高效液相色谱法测定小麦粉中间苯二酚含量的不确定度评定

◎ 金 梦，王 岚，宋 阳，官咏仪，张美金，钟 钰

（广州海关技术中心，广东 广州 510623）

间苯二酚（Resorcinol）有防腐杀菌的作用，可用作防腐剂，添加于化妆品和皮肤病药物糊剂及软膏中。间苯二酚对人体具有中等毒性，可引起肾脏损伤或其他中毒症状。因为间苯二酚的防腐作用，被用于小麦粉中作为改良剂。2017年底，原国家食品药品监督管理总局发布关于进一步加强小麦粉质量安全监管的公告，要求加强小麦粉质量安全监管，严查小麦粉滥用食品添加剂的行为，其中包括小麦粉中禁止使用间苯二酚[1]。

本文采用《小麦粉中间苯二酚的测定 高效液相色谱法》（BJS 202009）[2]中小麦粉的检测方法进行实验，依据《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL006：2019）[3]和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[4]，对测量结果进行不确定度评定，包括建立数学模型，量化已识别来源的不确定度分量，确定方法的合成标准不确定度和扩展不确定度，为小麦粉中间苯二酚检测的质量控制提供科学依据。正确地评定小麦粉中间苯二酚，以保证测试结果的质量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-20AD高效液相色谱仪（配荧光检测器，日本岛津公司）；D-78224 Singen超声清洗仪（德国ELMA）；3-18K高速离心机(德国SⅠGMA)。

间苯二酚标准品（纯度≥99%，Dr.Ehrenstorfer）；甲醇（色谱纯，广州同源化工科技有限公司）；亚铁氰化钾（分析纯，广州化学试剂厂）；乙酸锌(分析纯，广州化学试剂厂)；市售小麦粉。

1.2 标准溶液的配制

配制间苯二酚质量浓度为1.00 mg·mL-1的标准储备液和质量浓度为10.0 mg·L-1的标准中间液。配制质量浓度分别为 0.010 0 mg·L-1、0.020 0 mg·L-1、0.100 mg·L-1、0.200 mg·L-1和 0.500 mg·L-1系列标准工作溶液。

1.3 样品前处理

称取5 g（精确到0.001 g）试样于25 mL容量瓶中，加入15 mL甲醇旋涡混匀，超声15 min，放置至室温后加入1 mL亚铁氰化钾溶液和1 mL乙酸锌溶液，用甲醇定容至刻度，混匀1 min。于7 000 r·min-1离心3 min，取适量上清液过0.22 μm有机相滤膜后供液相色谱测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，0.5 μm）；流动相：甲醇-水（梯度洗脱）；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL；激发波长273 nm，发射波长304 nm。

1.5 建立数学模型

式中：X为试样中间苯二酚的含量，mg·kg-1；c为由标准工作曲线得出的试样中间苯二酚质量浓度，mg·L-1；V为试样提取液定容体积，mL；m为试样称样量，g。

考虑到样品的均匀性、前处理的损失和污染、仪器变动等因素影响结果的重复性f，应在公式中加入重复性修正因子，则公式转化为以下数学模型：

2 结果与分析

2.1 不确定度主要来源

根据《测量不确定度评定与表示》（JJF1059.1—2012）[4]评估小麦粉中间苯二酚的不确定度。其主要来源于间苯二酚标准溶液浓度（包括称重天平的校准和重复性影响，定容器具校准和重复性的影响）、标准工作曲线的拟合不确定度、试样称重m（包括校准、重复性的影响）、试样定容（包括温度、量具校准和重复性影响）和试样的含量测试重复性（样品的均匀性、样品前处理和仪器变动影响）等几个方面，不确定度分量的因果关系见图1[5-7]。

2.2 量化已识别的不确定度分量

2.2.1 间苯二酚标液的相对不确定度urel(Std)

（1）间苯二酚标准品纯度的相对不确定度urel(P)。标准证书给出间苯二酚标准品的纯度为99.83%，按矩形分布考虑，a=0.085%，包含因子属B类评定，标准不确定度则标准品纯度的相对不确定度

（2）间苯二酚标准品天平称重的相对不确定度urel(m标)。通过称重天平检定证书给出最大称量的示值误差测量结果U=0.02 mg（k=2），按正态分布采用B类评定，标准不确定度为线性不确定度分量应重复计算2次，一次皮重，一次总重，产生的天平校准引入的不确定度为标 准 品 称 量0.010 00 g，则标准品称重时引入的相对标准不确定度为称量使用的电子天平期间核查记录，重复性标准偏差为6.31×10-6g，天平称重的重复性引入因此间苯二酚标准品称重时引入urel(m标)=

（3）由配制间苯二酚标准溶液使用的玻璃量具引入的相对不确定度urel(V)。配制标准溶液过程中使用了10 mL容量瓶（单标线）、1 mL流出式分度吸量管和100 mL容量瓶（单标线）[8]。依据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[9]，A类10 mL容量瓶允差为±0.02 mL，按三角形分布采用B类评定，包含因子则标准不确定度为8.17×10-3，则量具校准引入的相对标准不确定度为量具重复性引入不确定度属A类评定，通过对典型的10 mL容量瓶充满10次并称量统计得出标准偏差为0.001 23 mL，充满液体至容量瓶刻度的重复性引入的相对标准不 确 定 度 为则10 mL容量瓶对相对标准不确定度为urel(dil1)=

同理计算A类1 mL流出式分度吸量管允差为±0.008 mL，重复性标准偏差0.003 01 mL，则1 mL分度吸量管相对标准不确定度urel(dil2)=4.44×10-3；A类100 mL单标线容量瓶允差为±0.10 mL，重复性标准偏差0.019 7 mL，则100 mL容量瓶相对标准不确定度urel(dil3)=4.56×10-4。则配制标准溶液使用的玻璃量具引入相对不确定度为：

综合（1）、（2）及（3）中的不确定度分量，可以得到配制间苯二酚标准溶液的不确定度为：

2.2.2 最小二乘法拟合曲线校准得出样液质量浓度的不确定度urel(c0)

测定间苯二酚标准液，其质量浓度分别为 0.0100 mg·L-1、0.0200 mg·L-1、0.100 mg·L-1、0.200 mg·L-1和 0.500 mg·L-1， 各 1 次， 得 到 质 量 浓度的峰面积响应值分别为 44 528 Au·s、71 785 Au·s、348 101 Au·s、697 693 Au·s和 1 669 251 Au·s。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行拟合得到线性回归方程A=B1c+B0=3.323 81×106c+14 519.8。式中n为标准溶液的测量次数，本例为5。对样品测试液进行测定，测定次数为p，本例为2，得到二次测定峰面积响应值结果为341 253 mV和339 381 mV，由直线方程求得平均质量浓度c0=0.098 0 mg·L-1，本例标准溶液的平均浓度cj为各标准溶液浓度，则c0的标准不确定度为：

则c0的相对标准不确定度：

2.2.3 小麦粉试样称重m的不确定度urel(m样)

根据电子天平检定证书给出最大称量的示值误差测量结果U=3 mg（k=2），标准不确定度为线性不确定度分量应重复计算2次，一次是皮重，一次是总重，则引入的不确定度为试样称重质量m为5.000 g，则试样称重m引入的相对标准不确定度为：

2.2.4 小麦粉试样前处理定容的不确定度urel(dil4)

试样前处理定容采用容量瓶（单标线25 mL），其不确定度包括校准、温度和重复性3个分量，其中重复性引入分量可合并入样品测定重复性中。定容的不确定度分量表见表1。本例提取溶液为甲醇，操作温度为（20±5）℃，20℃下甲醇的体积膨胀（α甲醇=1.18×10-3·℃-1）远比玻璃膨胀系数（α玻璃=2.5×10-5·℃-1）大，则温度对定容体积影响为Vtemp=V甲醇-V定容=α甲醇×V×ΔT=1.18×10-3×25×5=0.148 mL，按矩形分布采用B类评定，包含因子则温度变化引入的相对标准不确定度为：

表1 试样前处理定容的不确定度分量表

因此，试样前处理定容引入的不确定度为：

2.2.5 小麦粉试样含量测定重复性试验引入的相对不确定度

由于试样均匀性、前处理损失和仪器影响等因素都会引入不确定度，可将这些考虑包含在重复性实验内，通过加标回收试验评估重复性试验引入的不确定度。在同等条件下对试样进行6次加标独立实验，测试含量分别为 0.500 mg·kg-1、0.492 mg·kg-1、0.512 mg·kg-1、0.502 mg·kg-1、0.509 mg·kg-1和0.504 mg·kg-1，平均值为 0.503 mg·kg-1。按 A 类评定计算。试样标准偏差S=0.007 05，算术平均值标准不 确 定 度试 样含量测定重复性实验引入的相对标准不确定度

2.2.6 不确定度的合成及扩展不确定度的计算

小麦粉中间苯二酚含量测定不确定度的来源及测量值结果见表2，实验所得小麦粉中间苯二酚的含量x为0.503 mg·kg-1，则测量结果的合成标准不确定度为：

表2 测量不确定度分量表

按95%置信概率，取包含因子k=2，测量结果扩展不确定度为U=2u(x)≈0.035 mg·kg-1，测量间苯二酚含量可表示为（0.503±0.035）mg·kg-1（k=2）。

3 结论

本试验通过对高效液相色谱法测定小麦粉中间苯二酚的含量不确定度的评定方法建立数学模型，对整个测量过程不确定度来源进行量化分析，可以判断出不确定度主要来源于标准工作曲线拟合和试样含量测试的重复性试验所产生的不确定度，其次为标准品溶液的配制产生的不确定度，其他因素影响相对较小。最终得出小麦粉中间苯二酚的含量为（0.503±0.035）mg·kg-1，扩展不确定度为 0.035 mg·kg-1（k=2）。为获得较小的不确定度测定结果，应控制好关键环节，主要包括尽量选用质量好、校准合格的量具，分析人员熟练方法，规范标准溶液的配制，注意样品的均匀性，对分析天平和液相色谱仪定期校准维护保养，增加标准曲线点的测量次数和试样含量的测量次数，以减少标准曲线和试样重复性的不确定度，保证试验结果的准确性和可信度。