金银木松散型胚性愈伤组织的诱导

许丁帆 刘艳军 何远秦 黄俊轩 武春霞 李建科

摘 要：为建立金银木松散型胚性愈伤组织培养体系，该文研究金银木不同外植体、不同植物激素配比对金银木松散型胚性愈伤组织诱导与继代保持的影响。结果表明，金银木叶片为诱导愈伤组织最适外植体;叶片在MS（Murashige & Skoog Basal Medium，MS基础培养基）+0.5 mg/L BA（Benzylaminopurine，苄氨基腺嘌呤）+1.0 mg/L 2，4-D（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸，）培养基上可诱导出松散型愈伤组织，愈伤组织诱导率达100%;将松散型愈伤组织转接到MS+0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2，4-D培养基上，每20 d继代培养一次，继代培养2～3次后可获得金银木松散型胚性愈伤组织。

关键词：金银木;叶片;松散型胚性愈伤组织;培养基;激素

中图分类号：S793.9      文献标识码：A   文章编号：1006-8023（2022）02-0027-07

Induction of Loose Embryogenic Callus of Lonicera maackii

XU Dingfan， LIU Yanjun*， HE Yuanqin， HUANG Junxuan， WU Chunxia， LI Jianke

（College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract：In order to establish the culture system of loose embryogenic callus of Lonicera maackii， the effects of different explants and different plant hormone ratio on the induction and subculture maintenance of loose embryogenic callus were studied. The results showed that the leaf of L.maackii was the most suitable explant for callus induction; loose callus could be induced from the leaf of L.maackii on the medium of MS （Murashige & Skoog Basal Medium） +0.5 mg/L BA （Benzylaminopurine） +1.0 mg/L 2，4-D （2，4-Dichlorophenoxyacetic acid）， and the callus induction rate reached 100%; the loose callus were transferred to the medium of MS+0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2，4-D， and subcultured every 20 days， the loose embryogenic callus were obtained after subculture for 2-3 times.

Keywords：Lonicera maackii; leaf; loose embryogenic callus; culture medium; hormones

0 引言

金銀木（Lonicera maackii （Rupr.） Maxim.）又名金银忍冬，忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬属（Lonicera）落叶灌木或小乔木，生性强健，耐旱、耐寒，适应性强，对土壤要求不严，具有较强的重金属富集能力和空气净化能力，被广泛应用于园林绿化中，是华北地区重要的观花、观果树种之一。此外，金银木在医疗、食品及化妆品等产业均有较高的开发应用价值。当前，金银木苗木繁殖主要以播种和扦插繁殖为主，也可通过压条和嫁接等方式进行繁殖。但常规繁殖方式速度慢、效率低。

随着植物组织培养技术的发展，体细胞胚胎发生已逐渐成为植物大规模繁殖的主要方式，具有繁殖系数高、遗传稳定等优点。同时，利用体细胞胚胎发生技术和胚性愈伤组织的超低温保存技术，可实现优良种质资源的规模化生产和长期保存。而优质的胚性愈伤组织是体细胞胚胎发生的关键，是大规模植株再生的基础，是遗传转化的重要材料，也是研究植物单细胞分化和基因全能性表达的理想材料。

目前国内外对金银木的研究主要集中在有效成分提取和栽培等方面，对金银木组织培养方面的研究报道较少，仅在组培快繁方面进行了一定的研究，未见金银木愈伤组织诱导的相关研究报道。关于忍冬属植物的愈伤组织研究报道较多，如金银花（Lonicera japonica）、灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz）等已开展细胞悬浮培养及其次生代谢物生产的相关研究，但至今尚未见忍冬属植物胚性愈伤组织的有关研究报道。本试验以金银木不同外植体类型，通过调整培养基中激素的配比和用量，建立金银木松散型胚性愈伤组织诱导体系，为进一步诱导金银木体细胞胚胎发生奠定基础，为金银木体细胞离体诱变育种及次生代谢物生产等研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 外植体制备与消毒

选取天津农学院东校区内生长健壮、无病虫害的金银木植株，于4月上旬晴天的早晨，剪取腋芽未萌发的半木质化枝条，去除叶片和顶芽，保留叶柄，保湿带回实验室。将枝条置于自来水下冲洗10 min后，在超净工作台中，将枝条剪成2～3 cm 的带腋芽茎段，70%乙醇溶液浸泡20 s，再用2%有效氯的次氯酸钠溶液消毒4 min，消毒时不断摇动。消毒后用无菌水浸泡3次，每次5 min，其间不断摇晃。用无菌滤纸吸干茎段表面水分，并剪去两端消毒损伤部分，接种至1/2MS（Murashige & Skoog Basal Medium）+2.5 mg/L GA3（赤霉素）培养基上诱导腋芽萌发。

1.2 松散型愈伤组织诱导外植体的筛选

在金银木腋芽快速生长期，剪取长约0.5 cm的幼嫩茎段，茎段不带生长点;选择初展叶的叶片，剪成约0.5 cm×0.5 cm的小块;叶柄带叶片基部，长约0.5 cm，将外植体平置于愈伤组织诱导培养基表面。愈伤组织诱导培养基为MS+1.0 mg/L 2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），每种外植体接种6瓶，每瓶接种5个外植体，重复3次。每天对接种材料进行观察记录，30 d后统计形成愈伤组织的外植体数，并计算愈伤组织诱导率。

1.3 松散型愈伤组织诱导激素配比的筛选

将叶片接种到不同的松散型愈伤组织诱导培养基上，诱导培养基以MS为基本培养基，分别添加不同质量浓度BA（苄氨基腺嘌呤）、2，4-D。每种诱导培养基接种6瓶，每瓶接种5个外植体，试验重复3次。30 d后统计愈伤组织诱导率。

1.4 松散型胚性愈伤组织的诱导与继代保持

选取诱导的松散型愈伤组织外部易剥离的部分，从外植体上切下，大小约为0.25 cm3，选择生长状态基本一致的接种至不同的胚性愈伤组织诱导培养基上。培养基采用MS为基本培养基，分别添加不同质量浓度的BA、2，4-D。试验重复3次，每次重复接种10瓶，每瓶接种5块愈伤组织。每20 d继代培养一次，每次继代培养时选择结构松散、质地硬脆的新生愈伤组织，5次继代培养后记录愈伤组织生长速度、结构质地与颜色。每次继代培养后鉴定愈伤组织胚性情况。

1.5 胚性愈伤组织细胞学的鉴定

取少量愈伤组织用卡宝品红染液（Carbol fuchsin）或1%碘-碘化钾溶液染色后压片，使用Leica DM4000显微镜观察愈伤组织的胚性情况。

胚性愈伤组织细胞较小，细胞核大，胞质浓，部分细胞可见分裂相;1%碘-碘化钾溶液染色淀粉粒积累多。非胚性愈伤组织细胞大，形状为圆形、椭圆形或不规则形状，细胞核常偏向一侧且细胞核较小，无分裂相细胞;1%碘-碘化钾溶液染色淀粉粒积累少或没有淀粉粒积累。

1.6 培养条件

以上培养基均采用100 mL广口三角瓶为容器，每个三角瓶加入约40 mL的培养基。培养基均添加琼脂 7.0 g/L、蔗糖30 g/L，灭菌前调节pH为5.8～6.0，121 ℃、0.1 MPa下灭菌20 min。培养温度为25 ℃±2 ℃，24 h光照，光照强度1 000～1 500 lx。

1.7 數据统计分析

愈伤组织诱导率=（形成愈伤组织的外植体数/外植体总数）×100%。

试验数据采用excel 2013和SPSS Statistic 22.0进行数据分析，Duncans新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同外植体类型对愈伤组织诱导的影响

接种6～8 d后，大部分外植体伤口处出现黄白色愈伤组织，30 d后统计愈伤组织诱导率见表1。由表1可知，从愈伤组织结构与质地看，在MS+1.0 mg/L 2，4-D上，不同外植体诱导的愈伤组织无明显差异。但从愈伤组织诱导率看，不同外植体类型形成愈伤组织的能力存在差异，其中叶片的愈伤组织诱导率最高，表明金银木叶片的脱分化能力明显高于茎段和叶柄。同时，叶片诱导的愈伤组织生长速度也快于茎段和叶柄诱导的愈伤组织。因此，叶片是诱导金银木愈伤组织的理想外植体类型。不同外植体诱导愈伤组织情况如图1所示。

2.2 不同激素配比对松散型愈伤组织诱导的影响

由表2可知，不添加植物激素的对照很难诱导出愈伤组织，叶片外植体在培养基中逐渐褐化，仅少数外植体边缘出现极少量的点状绿色愈伤组织。当培养基中添加一定质量浓度的2，4-D后，金银木叶片愈伤组织诱导率显著提高，说明2，4-D对金银木愈伤组织的诱导影响显著。同时，2，4-D能够提高愈伤组织的生长速度，愈伤组织生长速度随着2，4-D质量浓度的提高而加快。当2，4-D在较低质量浓度0.5 mg/L时，愈伤组织生长速度较快，结构松散但质地较软，颜色呈白色，如图2（a）所示;当2，4-D质量浓度为1.0 mg/L时，愈伤组织生长速度变快，但诱导的愈伤组织仍为结构松散、质地较软的白色愈伤组织;当2，4-D质量浓度增大至2.0 mg/L时，愈伤组织生长速度快，为质地稀软的白色愈伤组织，如图2（b）所示，且随着培养时间的延长，愈伤组织出现部分褐化现象。当培养基中BA配合2，4-D使用时，愈伤组织质地与颜色发生较大变化。当0.5 mg/L BA配合较低质量浓度 0.5 mg/L 2，4-D时，愈伤组织结构松散，质地较硬，颜色呈黄色，如图2（c）所示;当0.5 mg/L BA配合1.0 mg/L 2，4-D的激素时，愈伤组织结构松散，质地较硬，生长速度变快;当0.5 mg/L BA配合2.0 mg/L 2，4-D时，愈伤组织生长速度快、结构松散、质地较软，如图2（d）所示，说明当0.5 mg/L BA配合 2，4-D使用时，愈伤组织质地会随着2，4-D质量浓度的增加而变软。当0.5 mg/L 2，4-D配合不同质量浓度BA时，愈伤组织结构会随着BA质量浓度的增加而变紧密，愈伤组织质地则随BA质量浓度的增加而变硬。当激素质量浓度为0.5 mg/LBA+1.0mg/L 2，4-D时，叶片外植体诱导得愈伤组织结构松散、质地较硬，生长速度较快，愈伤组织组织诱导率达100%，为理想的金银木松散型愈伤组织诱导培养基配方。

2.3 不同激素配比对胚性愈伤组织诱导与胚性保持的影响

将上步诱导的松散型愈伤组织转接到胚性愈伤组织诱导培养基上，5次继代培养时不同激素配比对胚性愈伤组织诱导与胚性保持效果不同，见表3。由表3可知，2，4-D对胚性愈伤组织诱导与胚性保持影响显著，不添加2，4-D或2，4-D质量浓度过高或过低均不利于胚性愈伤组织诱导与胚性保持。培养基中只添加0.5 mg/L BA时，5次继代培养均不能获得胚性愈伤组织，且随着愈伤组织继代次数

的增加，愈伤组织结构变致密、质地变硬，颜色为深绿色，继代培养1次如图2（e）所示，继代培养5次如图2（f）所示。当0.5 mg/L BA配合1.0 mg/L 2，4-D时，经5次继代培养，未能诱导出胚性愈伤组织，且愈伤组织质地随着继代次数的增加而逐渐变软，显微镜观察为无明显细胞核结构的薄壁细胞，如图3（b）所示。降低2，4-D质量浓度，愈伤组织逐渐向着胚性愈伤组织转变，但胚性愈伤组织的胚性化程度与胚性保持情况差异明显。当0.5 mg/L BA配合0.5 mg/L 2，4-D时，2次继代培养后可诱导出胚性愈伤组织，但愈伤组织不能完全保持胚性，部分胚性愈伤组织细胞逐渐转变为无明显细胞核结构的薄壁细胞。当0.5 mg/L BA配合0.25 mg/L 2，4-D时，可诱导出胚性愈伤组织，2次继代培养后经显微镜观察均为胚性愈伤组织细胞，且在此激素配比的培养基上，经过5次继代培养，松散型胚性愈伤组织可以稳定增殖且保持胚性。当0.5 mg/L BA配合0.1 mg/L 2，4-D时，5次继代培养均是胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织同时存在，愈伤组织不能完全胚性化。因此，理想的金银木松散型胚性愈伤组织诱导与胚性保持培养基配方为：MS+0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2，4-D。

3 结论与讨论

植物的体细胞经过重编程过程形成胚性愈伤组织，再从胚性愈伤组织细胞分化形成体细胞胚，这一过程为体细胞胚的间接发生途径。胚性愈伤组织是体细胞胚间接发生途径的前提。胚性愈伤组织的诱导受到母株基因型、外植体类型、培养基、激素和培养条件等诸多因素的影响。选择适宜的外植体类型是诱导胚性愈伤组织的关键因子之一。蒋娜等诱导灰毡毛忍冬愈伤组织，得出其叶片的愈伤组织诱导率远远高于茎段的诱导率，且刚刚萌发的外植体更适合诱导愈伤组织。因此，不同类型或同一类型处于不同发育阶段的外植体会直接影响愈伤组织诱导的结果。有研究表明，分生组织细胞和胚性细胞在组织学、形态学和超微结构上有许多相似之处。因此，含分生组织细胞多的外植体相对更容易诱导胚性愈伤组织。

植物生长调节剂是胚性愈伤组织诱导与保持的关键，其种类、质量浓度及配比决定了细胞发育的方向。在胚性愈伤组织诱导与增殖过程中往往同时添加生长素和细胞分裂素，适宜质量浓度的生长素与细胞分裂素配比能有效促进胚性愈伤组织的形成。本试验以BA 配合2，4-D使用可诱导金银木胚性愈伤组织，并发现2，4-D对胚性愈伤组织诱导与胚性保持影响显著，不添加2，4-D及2，4-D质量浓度过高或过低均不利于胚性愈伤组织诱导与胚性保持。龚雪琴等认为，2，4-D和6-BA在诱导朱顶红试管小鳞茎形成胚性愈伤组织和增殖继代中起关键作用。而张焕玲等认为诱导栓皮栎胚性愈伤组织最适宜的激素组合是NAA与BA 配合使用。说明不同植物对激素的反应不同。

本试验在诱导金银木胚性愈伤组织过程中发现，在胚性愈伤组织诱导的初始阶段，大多数愈伤组织细胞不具备胚性，需要几次继代培养后才逐渐分化为胚性愈伤组织。这与李爽等发现荔枝叶片愈伤组织需进行继代培养后才能诱导出胚性愈伤组织的结果相一致，可能是愈伤组织胚性化过程需要充足的养分和遗传物质积累。

同时，非胚性愈伤组织与胚性愈伤组织之间可以相互转换，其取决于所添加的激素种类及其质量浓度和愈伤组织本身的状态。而非胚性细胞在生长上容易占据优势，因此每次继代培养时需结合愈伤组织的细胞学鉴定，选择胚性愈伤组织进行继代培养。

本试验建立了金银木松散型胚性愈伤组织诱导与保持体系，为金银木大规模繁殖、体细胞离体诱变育种及遗传转化等研究奠定基础。关于金银木胚性愈伤组织的体细胞胚胎发生和超低温保存等有待进一步研究。

【参 考 文 献】

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