2017-2019年嘉兴地区非结核分枝杆菌流行状况分析

郁勤龙 王蔚 陆斌斌 李正江 赵二科

随着鉴定技术的发展，分枝杆菌种类日益增多，已达190多种。非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）是指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。NTM主要感染人体肺脏、淋巴结、骨骼、皮肤和软组织等，也可引起全身播散性疾病。目前NTM感染呈现快速增加的趋势［1-2］，已成为危害人类健康的公共卫生问题。全球NTM流行以鸟胞内分枝杆菌复合群（MAC）占据优势，各地NTM菌种分布和构成比存在差异，MAC中群内菌种构成比亦具有明显地域差异［3］。且同种NTM可根据地域差异而呈现不同的致病力，因此分析本地区的NTM分离情况更有助于明确其临床相关性［4］。本文分析2017～2019年嘉兴地区NTM流行优势菌种及其变化、所辖县区NTM流行情况，为本地区NTM防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2017年1月至2019年12月嘉兴市第一医院及所辖县区结核定点医院所有患者送检的痰液、肺泡灌洗液、脓液等标本分离得到的疑似非结核分枝杆菌菌株。

1.2 仪器与试剂 BACTEC MGIT 320分枝杆菌培养仪及其配套试剂（美国BD公司），硝基苯甲酸（PNB）罗氏培养基与抗酸染色试剂（中国广州珠海BASO有限公司），结核分枝杆菌抗原MPT64检测试剂盒（韩国标准诊断股份有限公司），细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化），OLYMPUS显微镜BX53（日本OLYMPUS）。

1.3 方法 （1）分枝杆菌初筛：参照2015年中国防痨协会《结核病实验室检验规程》［5］对包括痰液、肺泡灌洗液、脓液、尿液、淋巴结穿刺液等各类标本采用N-乙酰半胱氨酸（NALC）-NaOH处理后，接种于BACTECT MGIT 320液体培养基进行液体快速培养，仪器报阳管经抗酸染色确认抗酸阳性，MPT64胶体金测定阴性后，转种PNB罗氏培养基生长者，初步判定为NTM。（2）分枝杆菌菌种鉴定：初筛为NTM样本中吸取1 mL液体培养阳性菌液至1.5 mL离心管中，离心机离心半径为8 cm，13,000 r/min离心5 min后弃去上清液，加入75%乙醇振荡30 min灭活，重复离心弃上清，剩余沉淀中加入50μL核酸提取液混匀后，转移至核酸提取管并振荡5 min，置于95℃金属浴中5 min后取出，将该核酸样本交由杭州有康生物技术有限公司进行测序。鉴定方法采用16SrRNA、rpoB和hsp65基因序列片段检测，16SrRNA基因序列长度495bp，测序 引 物F：5'-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3'，R：5'-TTACCGCGGCKGCTGGCAC-3'；hsp65基因序列长度439bp，测序引物F：5'-ACCAACGATGGTGTCTCCA-3'，R：5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3'；rpoB基因序列长度342bp，测序引物F：5'-CGACCACTTCGGCACCG-3'，R：5'-TCGATCGGGCACATCCGG-3'，测序结果提交NCBI-BLAST网站进行同源性对比分析，同源性≥97%认为结果可接受。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NTM感染病例菌种分布 本地区共分离到初筛为NTM感染菌株为309例，剔除重复患者共245例，其中奴卡菌感染3例，分别为皮疽奴卡菌2株和星状奴卡菌1株，戈登氏菌感染1例为支气管戈登菌，NTM感染共241例。241例NTM感染患者中单一感染238例，混合感染4例（结核分枝杆菌合并胞内分枝杆菌3例，胞内分枝杆菌合并堪萨斯分枝杆菌1例），包含13个菌种，以胞内分枝杆菌最为多见，其次为堪萨斯分枝杆菌与脓肿分枝杆菌，见表1。

表1 NTM菌种分布及其构成比

2.2 NTM感染患者基本情况 241例患者中男132例，女109例，比例为1.2∶1；患者年龄主要集中于41～65岁（34.4%）与＞65岁（53.9%）区间。0～17岁仅0.4%；职业以农民（56.0%）与务工人员（24.9%）为主；各县区中NTM分离例数以南湖（22.8%）与嘉善（22.4%）较多，海宁（3.3%）较少，NTM分离种类以南湖（11种）与桐乡（9种）较多。不同性别、年龄和职业NTM感染患者的菌种分布差异有统计学意义（P＜0.05），不同县区NTM感染患者的菌种分布差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 NTM主要优势菌种分离率变化 2017年至2019年本地区分离得到非结核分枝杆菌242株，NTM分离率：2017年13.4%；2018年15.6%；2019年17.3%，总分离率15.2%，主要优势菌种为胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌。2017年至2019年堪萨斯分枝杆菌呈下降趋势（χ2=7.433，P＜0.01），胞内分枝杆菌与脓肿分枝杆菌无明显变化（P＞0.05），见表2。

表2 2017年至2019年NTM优势菌种分离情况及变化

3 讨论

非结核分枝杆菌广泛存在于水、土壤和灰尘等环境中，多为条件致病菌。近年来随着人口老龄化、免疫抑制剂使用增加及免疫缺陷病等原因［6］，NTM疫情日益严峻，同时感染死亡率亦明显增加［7-8］。

本资料结果显示，本地区NTM感染男性多于女性，以中老年农民为主，其次为务工人员，考虑与这两大人群的生活条件和营养水平较差相关，其中农民分离率更高可能与NTM存在于水资源、土壤等环境中造成农民暴露机会的增加相关。所有NTM绝大部分为呼吸道样本分离株，且以单一感染为主，混合感染少见，仅占1.7%。NTM总分离率为15.2%，高于全省整体水平4.69%［9］。NTM分离率从2017年的13.4%逐年升高至2019年的17.4%，形势不容乐观。2019年NTM分离数量绝对值虽有所减少但在分枝杆菌中所占比例升高，分析原因：①随着本地区经济生活水平提高，人群整体结核病疫情有逐年下降趋势；②随着Gene Xpert MTB/RIF检测技术的大规模推广应用，部分结核病患者仅依靠Gene Xpert MTB/RIF检测阳性进行诊断，并未进行分枝杆菌培养或培养阴性，从而造成结核分枝杆菌菌株检出减少。

各县区间NTM菌种流行情况无明显差异。南湖区NTM分离数量及种类最多，可能与其为市本级区域，人口基数多且流动性大，表现为NTM检出数量多且存在多样性，而桐乡市NTM分离总数量不多但种类较全，可能是当地发达的劳务市场吸引大量的外来务工人员输入所致。海宁市NTM分离较少，仅为3.3%，分析原因：一方面是由于基层医院正逐步采用Gene Xpert MTB/RIF检测代替分枝杆菌培养进行结核病诊断，导致NTM检出机会降低；另一方面可能与其经济水平高于其他县区，整体生活水平较高，NTM感染几率下降有关。

NTM菌种分布存在明显的地域差异，新加坡以脓肿分枝杆菌（49.9%）为主［10］；美国与日本以鸟胞内分枝杆复合群为主［11-12］；欧洲地区波兰和斯洛伐克以堪萨斯分枝杆菌为主，占35%～36%，而匈牙利以蟾蜍分枝杆菌（49%）为主［3］。本资料结果显示，本地区主要以胞内分枝杆菌（52.5%）为主，其次为堪萨斯分枝杆菌（19%）和脓肿分枝杆菌（18.6%）。杭州市（57.8%）［13］、绍兴市（51.9%）［14］以胞内分枝杆菌为主要菌种，与本资料结果一致。深圳市以脓肿分枝杆菌（41.6%）为主［15］；海南地区以龟/脓肿分枝杆菌（41.5%）为主［16］，与本资料结果存在较大差异。NTM流行由于地理环境以及气候等因素影响存在差异，因此不同地区感染者诊断治疗时需进行菌种鉴定。

近3年所有分离得到的NTM中胞内分枝杆菌年分离率较为稳定；脓肿分枝杆菌分离率无明显趋势性变化，但有略微提升；堪萨斯分枝杆菌出现明显下降趋势（P＜0.01）。堪萨斯分枝杆菌下降的原因可能为Gene Xpert MTB/RIF检测的大力推行改变结核病的诊断模式，造成部分涂阳样本无法获得阳性菌株，而该菌对一线抗结核药物耐药率相对较低［17-18］，同时相关指南推荐堪萨斯分枝杆菌感染的优先治疗方案为利福平、乙胺丁醇和异烟肼［19-20］，因此堪萨斯分枝杆菌感染患者抗结核治疗是有效的，可能被误认为是结核分枝杆菌感染，而造成本地区堪萨斯分枝杆菌疫情的低估。

综上所述，本地区NTM疫情处于较高水平，且呈升高趋势，主要以胞内分枝杆菌为主，其次为堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，且不同性别、年龄与职业感染人群NTM菌种分布存在差异，需根据既往感染患者的社会人口学及菌种分布特征，并结合当地实际情况制定有效的防治策略与措施。另一方面结核病诊断模式改变易造成NTM漏检而导致NTM感染诊断治疗难度增加，临床上应给予重视。因此推广快速、准确、经济的NTM检测新技术，做到早发现、早诊断、早治疗是本地区NTM防控的重点。