马铃薯StASR基因的生物信息学分析及基因克隆

王树林 李高峰 张荣 文国宏 李建武

摘要：将拟南芥AtASR基因核苷酸序列作为查询序列，在NCBI数据库中进行BLAST比对，得到马铃薯StASR基因（GenBank登录号：XM_006359742）的序列。通过生物信息学分析发现，该基因位于4号染色体上，基因長度为654 bp，编码108个氨基酸残基，其编码的蛋白质具有典型的ABA/WDS保守结构域。启动子区域分析后发现，马铃薯StASR基因含有水分响应元件MYCATERD1、冷胁迫响应元件DRECRTCOREAT和盐胁迫响应元件GT1GMSCAM4等多种与非生物胁迫响应相关元件以及马铃薯生长发育相关顺式作用元件，对其进行蛋白质互作网络的分析发现与低温、水分胁迫等基因互作。用PCR技术成功的克隆到马铃薯StASR基因，其结果可以为深入研究马铃薯StASR基因的功能提供基础。

关键词：ASR基因;干旱胁迫;马铃薯;生物信息学

中图分类号：Q781;S532            文献标志码：A            文章编号：1001-1463（2022）03-0020-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.03.005

Bioinformatics Analysis and Cloning of the StASR Gene in

Solanum tuberosum

WANG Shulin 1， 2， LI Gaofeng 1， 2，  ZHANG Rong 1， 2， WEN Guohong 1， 2， LI Jianwu 1， 2

（1. Institute of Potato， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. National Germplasm Resources Agricultural Experimental Station， Weiyuan Gansu 748201， China）

Abstract：In this experiment， the sequence of the potato StASR gene（Genbank Accession number：XM_006359742） was obtained by BLAST comparison in NCBI database using the nucleotide sequence of the Arabidopsis AtASR gene as the query sequence. Bioinformatics analysis revealed that the gene was located on chromosome 4 with a length of 654 bp and encodes 108 amino acid residues， and the encoded protein has a typical ABA/WDS conserved domain. After analyzing the promoter region， it was found that the potato StASR gene contains water response element MYCATERD1， cold stress response element DRECRTCOREAT， salt stress response element GT1GMSCAM4 and other abiotic stress response related elements as well as potato growth and development related cis-acting elements. The analysis of protein interaction network found that it interacted with genes such as low temperature and water stress. In addition， the potato StASR gene was successfully cloned by PCR technology， and the results can provide a basis study of the function of the potato StASR gene.

Key words：ASR gene;Drought stress;Potato;Bioinformatics

植物在生长发育的过程中生长环境对其产生重大的影响。为应对环境中的各种非生物胁迫，植物自身发展出了复杂的调控网络来适应环境带来的影响[1 ]。尽管越来越多的非生物胁迫调控网络被鉴定出来，但许多功能机制还尚未完全明确。

ASR蛋白是一类高等植物中特有的蛋白质，具有小而亲水的特征[2 ]。第一个ASR蛋白在番茄（Solanum lycopersicum L.）中被分离出来后[3 ]，越来越多的植物中，如百合（Lilium L.）、葡萄（Vitis vinifera L.）、水稻（Oryza sativa L.）和玉米（Zea mays L.）中也相继鉴定到ASR基因[4 ]。研究发现ASR蛋白具有典型的由60～80个氨基酸残基构成高度保守的ABA/WDS（abscisic acid/water deficit stress） 结构域，并且在N端具有锌指结合位点。ASR蛋白能够以单体或者复合体的形式与特定的DNA结构结合[5 ]。虽然在多种作物中已经克隆到ASR基因，但其ABA/WDS结构域的功能并不明晰，其蛋白质由70～230个氨基酸残基组成[6 ]。具有ABA/WDS结构域的蛋白质复合物能够响应干旱胁迫、盐碱胁迫、低温胁迫。在干旱胁迫的调控中能够响应依赖于ABA的调控途径[7 ]，在低温胁迫的调控中以分子伴侣的形式进行调控。另外在植物生长发育的各个时期也具有重要的调控作用，如在花粉发育、果实成熟和植株衰老的过程中表达量都有显著变化[8 ]。在干旱胁迫相关研究中，将ASR基因在水稻中进行超表达后发现转基因水稻的耐旱能力得到大幅提升，其中ASR3也成为水稻耐旱关联图谱的候选基因[9 ]。将外源ASR基因在拟南芥中进行超表达也提高了拟南芥的耐旱性和耐盐碱性[10 ]。有研究证实，在水稻中ASR蛋白在干旱响应调节通路中通过减轻细胞膜损伤，保持水分含量来提高作物的耐旱性[9 ]。然而，ASR蛋白是否在渗透胁迫下作为一个调控因子通过激活植物抗氧化系统和其他胁迫相关的基因开始转录来参与ROS稳态的调节目前还尚未阐明。

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是世界上主要的粮食作物，非生物胁迫如干旱、盐碱、低温均对其植株生长发育和块茎的膨大具有较大的影响[11 ]。尽管有研究表明ASR蛋白在馬铃薯块茎中响应盐碱胁迫，但该基因在干旱和盐碱胁迫中的信号通路机制尚不清楚[12 ]。我们分析了马铃薯StASR基因的结构和蛋白质互作网络，以期为进一步研究StASR基因在逆境胁迫响应网络中的功能提供参考。

1   材料与方法

1.1   试验材料

试验所用的PCR 酶、T4连接酶、限制性内切酶和pMD18-T载体等均购自大连宝生物公司。RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒等均购自TANGEN公司。指示马铃薯品种为大西洋。盆栽马铃薯在温室中的生长条件为：生长温度（24±2） ℃，白天/夜晚光照周期为16/8 h。取样后立即用液氮处理并存储于-80 ℃ 冰箱。

1.2   生物信息学分析

将拟南芥AtASR基因作为同源序列在NCBI中进行BLAST比对，得到马铃薯StASR基因序列。将得到的马铃薯StASR基因的全基因组序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行BLAST同源比对，找到相似度较高的其他物种ASR基因序列做进化树。StASR基因在染色体上所处的位置分析使用马铃薯数据库（http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download. shtml）。启动子分析采用在线网站（https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action= newplace）。蛋白质一级结构分析采用ExPAy （https：//web.expasy.org/protparam/）。蛋白互作网络分析采用在线网站（https：//string-db.org/）。

1.3   马铃薯总RNA的提取及StASR基因的克隆

对供试马铃薯品种大西洋进行取样后，提取马铃薯总RNA，反转录成cDNA作为DNA克隆模板。根据马铃薯StASR 基因序列设计PCR克隆引物，正向引物为StASR-F：CGCGGATCCACAACA TTATCTCATCACTCACGC;反向引物为StASR-R：CGG GGTACCTCAAGCACTCTGAAGGGAAAC。用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳后将PCR产物进行胶回收。

2   结果与分析

2.1   马铃薯StASR基因及其蛋白质分析

生物信息学分析表明，马铃薯StASR基因位于马铃薯第4号染色体上，基因长度654 bp，放阅读框长度为327 bp。NCBI Splign分析结果（图1）显示，StASR蛋白结构分析发现包含有典型的ABA/WDS结构。采用蛋白质分析在线软件分析蛋白一级结构发现，蛋白质化学式为：C538H819N165O158S1，该蛋白由108个氨基酸残基构成。分子量为12 158.49 Da，理论等电点为6.65，其中含量较高的氨基酸有Glu、His和Lys，都达到了16.7%;含量较低的氨基酸有Gln和Met，仅占0.9%。另外分析发现有21个带负电的氨基酸残基（Asp + Glu），带正电的（Arg + Lys）共有18个。蛋白质不稳定系数为46.37，将该蛋白性质归类为不稳定蛋白质。

2.2   马铃薯StASR基因进化分析

通过NCBI进行BLAST得到7个物种与马铃薯StASR基因同源性较高的蛋白序列。通过MEGAX软件使用NJ邻进法构建分子系统进化树（图2）。结果显示，马铃薯StASR基因与番茄具有高度相似的进化关系，与黄瓜与凤梨的次之，与水稻及玉米的进化关系最远。分析结果与马铃薯进化关系基本相一致。

2.3   马铃薯StASR基因的启动子区分析

对基因启动子上游序列1 000 bp的区域进行分析发现，马铃薯StASR基因包含不同的顺式作用元件，如脱落酸（ABA）响应元件ABREZMRAB28。脱水响应元件ABRELATERD1。与非生物胁迫响应的相关元件，如水分响应元件MYCATERD1、冷胁迫响应元件DRECRTCOREAT、盐胁迫响应元件GT1GMSCAM4。另外还包含一些与光调节相关的顺式作用元件，如元件GT1CONSENSUS和较多的DNA结合元件ARR1AT（表1）。这些元件显示马铃薯StASR基因可能在其逆境胁迫机制中发挥重要作用。

2.4   马铃薯StASR基因的克隆

以供试马铃薯品种大西洋提取RNA后反转录合成cDNA为模板进行基因PCR扩增。扩增引物根据马铃薯StASR基因序列设计，PCR扩增引物为：正向引物为StASR-F：CGCGGATCCACAACATTAT CTCATCACTCACGC;反向引物为StASR-R：CGG GGTACCTCAAGCACTCTGAAGGGAAAC。PCR扩增结束后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳得到长度为570 bp左右长度的DNA片段（图3），其大小符合预期。将PCR产物进行回收，回收目的片段通过T4-DNA连接酶将其连接在克隆载体上。

2.5   马铃薯StASR蛋白互作网络分析

通过在线软件STRING进行马铃薯StASR蛋白互作网络分析（图4）显示，马铃薯StASR蛋白与脂质转运相关蛋白（putative LTP）、磷酸酶蛋白、生长素响应蛋白（IAA4）、泛素连接酶蛋白、低温响应蛋白、肽酶、硝酸盐蛋白具有互作作用，说明马铃薯StASR蛋白能够参与到生长发育和逆境胁迫响应当中。

3   结论与讨论

通过生物信息学的方法分析了马铃薯StASR基因与其他物种中的同源基因，从基因结构、启动子区域分析、蛋白理化性质、物种进化关系、蛋白互作网络5个角度分析表明，该基因位于4号染色体上，基因长度为654 bp，编码108个氨基酸残基，其编码的蛋白质具有典型的ABA/WDS保守结构域，并且在进化关系上与番茄高度相似，说明马铃薯StASR基因在与茄科作物进化分歧前就发生复制现象，起源较早[13 ]。启动子区域分析后发现，马铃薯StASR基因含有水分响应元件MYCATERD1、冷胁迫响应元件DRECRTCOREAT和盐胁迫响应元件GT1GMSCAM4等多种与非生物胁迫响应相关元件，对其进行蛋白质互作网络的分析发现与低温，水分胁迫等基因互作。另外用PCR技术成功的克隆到马铃薯StASR基因，其结果可以为深入研究马铃薯StASR基因的功能提供基础。启动子区分析和蛋白质一级结构分析发现其基因上游区间有水分、低温、盐碱胁迫相关的响应元件，表明马铃薯StASR基因能够参与到逆境胁迫响应的通路当中。另外在蛋白质互作网络分析中发现马铃薯StASR蛋白能与低温、干旱和生长发育相关的10个蛋白质互作，也说明其能够调节作物响应逆境胁迫的能力。

马铃薯是我国第三大粮食作物和四大主粮作物之一[14 - 15 ]。马铃薯StASR基因虽然结构简单，但其广泛的参与到马铃薯对逆境胁迫响应信号通路中，对马铃薯抗旱调节具有重要的潜在作用[16 ]。我们仅对马铃薯StASR基因在基因结构、蛋白功能方面进行了分析，其在调控网络中的具体作用机制还需要进一步的研究。在干旱胁迫中依赖于ABA或者独立于ABA的信号通路中都有ASR基因参与。在水分胁迫下，番茄SlASR基因与百合ASR基因表达量显著升高[17 ]。 草莓FaASR基因与葡萄VsASR基因在外源ABA处理下都有显著的升高[18 - 19 ]。另外有研究表明，病原菌也会诱导ASR基因的表达，如樟疫霉菌（Phytophthora cinnamomi）、枯萎病菌（F. oxysporun f. sp. Cubense）能够使ASR基因或者同源蛋白的表达量增高[20 ]。在不同作物的不同生长发育时期ASR基因的表达模式也不相同。番茄中果实在成熟期SlASR2基因表达量下降，草莓果实转色后基因表达量上升，葡萄从坐果期到成熟期VvASR基因的表达量先升高后降低[21 ]。将PVX、PVS、PVY和PLRV 4种病毒CP融合基因導入马铃薯，并对影响遗传转化的因素进行了优化[22 ]。

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收稿日期：2021 - 11 - 24;修订日期：2022 - 01 - 09

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31760410）;甘肃省种业攻关项目（GZGG-2021-4）;现代丝路寒旱农业马铃薯产业发展项目（GNKJ-2020-1）;甘肃省农业科学院生物育种专项（2020GAAS10）。

作者简介：王树林（1992 — ），男，甘肃古浪人，研究实习员，硕士，研究方向为植物分子生物学。联系电话：（0931）7706264。Email：1825631205@qq.com。