抗虫-耐除草剂转基因玉米种植对土壤固碳细菌群落的影响

王 蕊，李 刚，修伟明，王丽丽，赵建宁

（农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191）

据ISAA最新报告指出，目前全球转基因作物累计种植面积已达到了25亿hm2，从转基因作物商业化种植以来约增长了113倍[1].随着转基因作物种植面积的不断增加，其种植对环境安全的影响也受到社会各界的关注.土壤是陆地生态系统最大的碳库，是碳循环的重要组成部分[2].生物固碳可提高生态系统的碳固定及存储[3]，是公认的经济环保的固碳方式[4].目前发现了7条生物固碳途径[5]，其中，卡尔文循环是自然界中最主要的生物固碳途径[6]，亦是调控大气CO2浓度的主要途径，参与各个生态系统的CO2固定和有机化合物的合成[3].1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（RubisCO）是卡尔文循环中的关键酶，根据分子生物学方法并且按照结构、催化型和对O2的敏感性，RubisCO可分为4类（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）[6].RubisCOⅠ主要存在于能进行光合作用的有机体内，RubisCOⅠ大亚基编码的cbbL基因承担了全部的催化功能并具有高度保守性，经常作为固碳微生物的标记物[6].

转基因玉米是全世界种植最多的4种转基因作物之一.目前，已在非靶标生物、土壤动物群落结构、土壤细菌和真菌群落多样性等方面[7-9]对转基因玉米进行了研究.本课题组已针对转基因玉米对土壤古菌[10]和固氮细菌[11]群落结构多样性的影响进行了研究，结果表明转基因玉米对土壤古菌和固氮细菌的丰度、群落多样性和组成均无显著影响.本研究以携带有抗虫基因cry1Ab和耐除草剂基因epsps的转基因玉米C0030.3.5为研究对象，利用qPCR和T-RFLP技术，探究该转基因玉米的种植对土壤固碳微生物丰度和群落结构的影响，以期从多方面、多角度为评价转基因玉米的环境安全性提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验地概况

实验地位于吉林省四平市伊通满族自治县民主村（北京大北农生物技术有限公司吉林省实验示范基地），北纬43°15′，东经125°20′.气候类型为中温带湿润季风气候，多年平均降水量为627.8 mm，全年平均气温为4.6℃，无霜期138 d.供试土壤类型为白浆土[12].实验地基本情况见文献[12]报道.

实验对象为北京大北农生物技术有限公司提供的亲本非转基因玉米（DBN318）（PM）、携带有抗虫基因cry1Ab和耐除草剂基因epsps的转基因玉米（C0030.3.5）（TM）.实验采用随机区组设计，每个玉米品种分别选取3个10 m×15 m的小区（即3次重复）.样地具体情况见文献[12]报道.

1.2 土壤样品采集

分别于玉米生长的拔节期（2016年7月6日，J）、抽雄期（2016年7月27日，T）、乳熟期（2016年8月24日，M）和完熟期（2016年9月27日，R），采用十字交叉法采集土壤样品.将同一生长时期同一小区的土壤样品混匀分成2份，一份用于测定土壤理化性质，另一份用于分子生物学实验（-70℃冰箱保存）.具体采集方法及样品处理参照文献[10].

1.3 分析方法

测定土壤理化性质：土壤pH值、水的质量分数、有机质、全磷、速效磷含量的测定方法参照文献[13].使用流动分析仪（AA3-HR，德国Seal公司）测定土壤全氮、铵态氮和硝态氮含量.

提取土壤总DNA：使用PowerSoilTMTotal DNA Isolation试剂盒（美国Mo Bio Laboratories）对0.25 g土壤样品（-70℃冰箱保存）提取土壤总DNA.具体操作步骤参照文献[10].

定量PCR分析：使用qPCR引物对k2f（ACCAYCAAGCCSAAGCTSGG）和v2r（GCCTTCSAGCTTGCCSACCRC），测定土壤固碳细菌的cbbL基因丰度.反应程序和体系参照文献[14].所有样品和无模板对照均设置3次重复.本研究扩增效率为88.2%，R2等于1.000.

末端限制性片段长度多态性（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）分析：利用T-RFLP技术测定土壤固碳细菌cbbL基因的多样性，所用引物对k2f和v2r同上.用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system试剂盒（美国Promega公司）进行扩增，将得到的3次纯化产物混匀，酶切（HhaⅠ、MspⅠ）后送至生工生物工程（上海）有限公司进行自动测序分析.按照文献[15]中的方法，对测序结果进行计算处理，获得末端限制性片段（terminal-restriction fragment，T-RF）的相对丰度（Ra）数据，Ra>1%的T-RFs纳入后续分析，Ra>10%的T-RFs定为优势种群.

1.4 数据处理

采用SPSS22.0中的单因素方差分析法（Duncan法）进行多组间差异统计学意义分析，采用独立样本t检验进行两组间差异统计学意义分析.采用Origin 9.1进行绘图.采用Canoco for windows 4.5.1进行软件RDA分析.

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

2个玉米品种所在样地的土壤理化性质如表1所示.由表1可以看出，玉米的4个生长时期中，同一生长时期PM和TM样地土壤的理化性质差异不具有统计学意义（P>0.05）.在不同生长时期，同一玉米品种所在样地的土壤理化性质存在差异.对非转基因玉米分析表明：土壤pH值和全氮含量在乳熟期和完熟期显著高于拔节期和抽雄期的数值（P<0.05）；土壤中水的质量分数在抽雄期和完熟期显著高于拔节期和乳熟期的数值（P<0.05）；土壤有机质含量在完熟期显著高于拔节期和抽雄期的数值（P<0.05）；土壤的全磷和硝态氮含量在拔节期显著高于其他3个时期的数值（P<0.05）；土壤铵态氮含量在乳熟期显著高于抽雄期和完熟期的数值（P<0.05）.对转基因玉米分析表明：土壤pH值和有机质含量在乳熟期和完熟期显著高于拔节期和抽雄期的数值（P<0.05）；土壤中水的质量分数在抽雄期最高（P<0.05）；土壤全氮含量在完熟期显著高于拔节期（P<0.05）；土壤铵态氮含量在乳熟期最高（P<0.05）；土壤硝态氮含量在拔节期最高（P<0.05）；土壤速效磷含量在完熟期最低（P<0.05）.

表1 2个玉米品种所在样地的土壤理化性质Tab.1 Physical and chemical properties of soil in sample sites of two maize varieties

2.2 土壤固碳细菌的cbbL基因丰度

2个玉米品种土壤固碳细菌的cbbL基因丰度如图1所示.每克土壤中，PM和TM土壤固碳细菌cbbL基因丰度的范围分别为5.62×108~9.02×108copies和5.83×108~7.47×108copies.PM在拔节期、抽雄期和乳熟期的土壤固碳细菌cbbL基因丰度大于TM的数值，在完熟期略低于TM的数值，但差异不具有统计学意义（P>0.05）.随着生长时期的推进，PM和TM所在样地的土壤固碳细菌cbbL基因丰度均呈先升高后降低的趋势，在乳熟期达到最大值，但不同生长时期的丰度差异不具有统计学意义（P>0.05）.

图1 2个玉米品种的土壤固碳细菌cbbL基因丰度Fig.1 Abundance of the soil cbbL gene in two maize varieties

2.3 土壤固碳细菌cbbL基因丰度与土壤性质的关系

对土壤固碳细菌cbbL基因丰度与土壤理化性质进行相关性分析，结果如表2所示.由表2可以看出，土壤固碳细菌cbbL基因丰度与硝态氮含量呈极显著正相关（P<0.01），与pH值呈极显著负相关（P<0.01），与有机质含量呈显著负相关（P<0.05）.

表2 土壤固碳细菌cbbL基因丰度与土壤理化性质之间的相关系数Tab.2 Correlation coefficients for relation between cbbL gene abundance and physical and chemical properties of soil

2.4 土壤固碳细菌群落的T-RFLP分析

玉米不同生长时期土壤固碳细菌cbbL基因的TRFs相对丰度如图2所示.

图2 2个玉米品种的土壤固碳细菌cbbL基因T-RFs相对丰度Fig.2 Average relative abundance of T-RFs of the soil cbbL gene in two maize varieties

从PM和TM不同生长时期的土壤中共获得25种不同长度的T-RFs.其中，26（7.46%~25.88%）、41（7.71%~20.46%）、57（13.26%~41.31%）和125 bp（5.14%~11.53%）片段所代表的物种为所有土壤中的优势种群.玉米的4个生长时期中，同一生长时期PM和TM的优势片段的相对丰度差异不具有统计学意义（P>0.05）.除TM在抽雄期118 bp片段的相对丰度、在乳熟期10 bp片段的相对丰度以及34 bp片段的相对丰度显著高于PM的数值外（P<0.05），PM和TM的其余片段在同一生长时期的相对丰度差异不具有统计学意度（P>0.05）.

在不同生长时期，PM的26 bp片段相对丰度在拔节期最高（22.54%），在完熟期最低（12.05%）；41 bp片段相对丰度在乳熟期最高（20.46%），在完熟期最低（7.71%）；57 bp片段相对丰度在抽雄期最高（41.31%），在乳熟期最低（21.75%）；125 bp片段相对丰度在完熟期最高（11.07%），在抽雄期最低（5.14%）.TM的26 bp片段相对丰度在抽雄期最高（25.88%），在完熟期最低（7.46%）；41 bp片段相对丰度在乳熟期最高（13.67%），在完熟期最低（7.81%）；57 bp片段相对丰度在完熟期最高（39.36%），在拔节期最低（13.26%）；125 bp片段相对丰度在乳熟期最高（11.53%），在拔节期最低（5.45%）.

2.5 土壤固碳细菌cbbL基因多样性指数的比较

根据T-RFLP酶切片段的种类和丰度计算土壤固碳细菌的多样性指数，从物种丰富度（Shannon指数）和均一性（Evenness指数）2个方面反映土壤固碳细菌群落结构的多样性，结果如表3所示.由表3可以看出，玉米的4个生长时期中，同一生长时期PM和TM的土壤固碳细菌cbbL基因的Shannon指数和Evenness指数差异均不具有统计学意义（P>0.05）.随着生长时期的变化，PM的Shannon指数和Evenness指数均表现为先降低后升高的趋势，TM的Shannon指数和Evenness指数均表现为降低的趋势.在拔节期，PM的Shannon指数和Evenness指数均显著高于乳熟期的数值（P<0.05），TM的Shannon指数和Evenness指数均显著高于完熟期的数值（P<0.05）.

表3 2个玉米品种的土壤固碳细菌cbbL基因的多样性指数Tab.3 Diversity index of soil cbbL gene in twomaize varieties

2.6 土壤固碳细菌群落与环境因子的RDA分析

选取土壤固碳细菌群落的T-RFLP结果和土壤理化性质进行RDA分析，结果如图3所示.由图3可知，前2个排序轴总共可解释cbbL基因多样性变化的28.8%，土壤pH值（P=0.002）、硝态氮含量（P=0.004）和有机质含量（P=0.046）与固碳细菌群落组成显著相关.拔节期PM和TM的土壤固碳细菌均分布在第4象限内，其余3个时期PM和TM的土壤固碳细菌分布在其他3个象限内，说明玉米拔节期与其他3个时期的土壤固碳细菌的结构差异明显.

图3 2个玉米品种的土壤固碳细菌群落结构的RDA分析Fig.3 RDA analysis of soil carbon sequestrating bacterial in two maize varieties

3 讨论与结论

本研究分析了种植抗虫-耐除草剂转基因玉米（C0030.3.5）对土壤固碳细菌基因丰度、多样性和群落结构的影响.由qPCR分析可以看出，在同一生长时期非转基因玉米PM和转基因玉米TM的土壤固碳细菌cbbL基因丰度差异不具有统计学意义（P>0.05）.随着生长时期的变化，PM和TM的土壤固碳cbbL基因丰度均呈先升高后降低的趋势，均在乳熟期最高，但不同时期的差异不具有统计意义（P>0.05）.相关分析结果表明，土壤固碳细菌cbbL基因丰度与硝态氮含量呈极显著正相关（P<0.01），与pH值呈极显著负相关（P<0.01），与有机质含量呈显著负相关（P<0.05）.微生物合成体细胞需要一定数量的碳和氮，碳源由固碳细菌固定CO2提供，而氮源由土壤提供，土壤有效养分硝态氮的含量变化对固碳细菌有显著影响[16].通常认为，土壤pH值下降、土壤营养元素和有机质含量增高可为微生物提供能源，有利于微生物生长[17].然而本研究分析发现，固碳微生物的丰度与有机质含量呈显著负相关，这一结果与刘茗等[18]研究阔叶林土壤固碳微生物、苏鑫等[19]研究盐碱土壤固碳微生物的结果相同.土壤自养细菌对环境变化和人类活动，如种植模式、灌溉、土地利用和耕作等非常敏感[20].本研究中固碳细菌丰度与有机质含量呈负相关，可能是因为本研究的土壤类型为白浆土且进行了耕作和种植，从而引发固碳细菌丰度的变化，具体原因还需进一步研究.土壤pH值也会间接影响土壤有机质的分解和养分释放，导致对生境变化较敏感的微生物种群丰度发生变化[21].

由T-RFLP分析数据可以看出，虽然PM和TM在各个时期不同长度的T-RFs所占比例存在差异，但是土壤cbbL基因优势种群均为26、41、57和125 bp片段所代表的种群，说明土壤固碳细菌优势种群结构组成未发生变化.从多样性指数（Shannon指数和Evenness指数）可以看出，同一生长时期的PM和TM玉米，其所在样地土壤固碳细菌cbbL基因的群落结构多样性之间的差异不具有统计学意义（P>0.05）.随着生长时期的推进，PM的多样性指数均表现为先降低后升高趋势，TM的多样性指数均表现为降低趋势，PM和TM不同生长时期的土壤固碳细菌cbbL基因的群落结构多样性存在差异.RDA综合分析结果表明，土壤固碳细菌群落结构主要受土壤pH值、硝态氮和有机质含量3个因子的调控[19].土壤固碳细菌群落在不同生长时期发生明显分离.土壤pH值被认为是决定土壤碳固定的主要因素[22].土壤硝态氮含量与固碳细菌群落组成显著相关，这与禹飞[23]的研究结果一致.土壤固碳细菌是一类主要利用CO2为碳源的自养生物，还可利用有机物作为碳源和能源，有机物分解产生的CO2亦可为其提供底物[20].玉米不同生长时期的土壤理化性质和养分发生改变，可影响微生物的代谢活动，进而导致固碳微生物的群落结构发生变化[6].

总的来看，种植抗虫-耐除草剂转基因玉米（C0030.3.5）对土壤固碳细菌cbbL基因丰度和多样性的影响不显著.玉米不同生长时期，转基因玉米和非转基因玉米样地的土壤理化性质、土壤固碳细菌cbbL基因丰度和多样性均发生变化，土壤的pH值、硝态氮和有机质含量是驱动土壤固碳细菌群落结构变化的关键因子.