子午岭保护区刺五加紫丁香苷、多糖及黄酮含量分析

宋惠子，山宝琴*，张永涛，杨晓军，王 超

（1.延安大学石油工程与环境工程学院；2.延安大学 化学与化工学院，陕西延安 716000）

子午岭国家级自然保护区位于陕西省延安市南部富县境内，地处中国暖温带落叶阔叶林的西端［1］，保护对象主要是黄土高原稀有的天然次生林生态系统及野生动植物资源［2］。其中刺五加（Acant h opanax senticosus）是子午岭国家保护区珍稀保护植物之一，也是中国一直利用的珍贵药用植物资源。刺五加的干燥根及根茎，有益气健脾、补肾安神的功效［3］，大多分布于中国东北地区。刺五加体内含有多种苷类、多糖和黄酮类等化学活性成分，其根、茎和叶均可入药，药用价值十分广泛［4］。其中刺五加苷具有抗疲劳、抗衰老、止血等功效，多糖成分能够抗肿瘤、降血糖、调节免疫等，黄酮类还可调控心脑血管系统［5］。因此，对于刺五加化学活性成分含量的研究有助于对其药理作用的进一步发掘［6］。

目前针对刺五加化学活性成分的研究主要侧重于含量、药理作用等方面，研究样地集中于东北、甘肃和宁夏等地区，陕北地区的资源分布及药用价值等少见报道。因此，以陕北子午岭保护区野生刺五加的茎干、新枝及嫩叶等为研究材料，测定刺五加不同部位中紫丁香苷、多糖及黄酮含量，分析陕北地区刺五加不同部位紫丁香苷、多糖和黄酮含量与其他地区差异，对其不同部位质量进行综合评价，旨在揭示陕北地区野生刺五加潜在药用价值，并为其进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

采样点位于陕北子午岭国家级自然保护区，陕西省富县境内，林区呈南北走向。总面积为4.06×108m2，森林覆盖率为88.3%，年平均气温为7.4℃，全年降水量平均为500~600 mm，海拔为920~1 680 m，地貌为陕北黄土高原丘陵沟壑的典型类型。

1.2 样品采集与处理

2021年6月在子午岭保护区槐树庄周边，东经108°43′，北纬35°51′，海拔1 260 m，经野外调查后选取典型分布区中长势均匀的标准刺五加10株，分别采集刺五加茎、枝和嫩叶等不同部位样品，装入纸质包装袋。以上选材经自然风干、粉碎后过60目筛，备用。

1.3 研究方法

采取高效液相色谱法［7］来测定刺五加紫丁香苷含量。刺五加样品与95%工业酒精1∶4混合，并用超声波仪在水温25℃下萃取8 h，随后过滤得到刺五加提取液。分析时，选取流动相甲醇∶水=1∶1、C18反向柱、进样量10µL、升流速0.5 mL/min、柱温25℃，采用UV检测器（265 nm）进行检测。所用甲醇为色谱纯，水为超纯水，且经0.45µm微孔滤膜过滤。

采用苯酚-硫酸法［8］测定刺五加多糖含量。取1.0 g刺五加不同部位样品，以料液比1∶10，在功率480 W、频率40 kHz、温度55℃条件下，超声提取30 min制成供试品溶液，另外配制0.15 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。分别吸取葡萄糖对照品溶液、刺五加不同部位供试品溶液各2.0 mL，置于10 mL具塞试管中，然后加入1.0 mL苯酚，充分混匀后加入5.0 mL浓硫酸，混匀放置30 min后，在490 nm波长下进行全波长扫描比色并记录吸光值，根据标准曲线，计算出刺五加不同部位多糖含量，公式如下：

式中，C为测得的葡萄糖样品质量浓度（mg/mL）；V为供试液体积（mL）；M为供试品质量（mg）。

采用紫外分光光度法［9］测定刺五加黄酮含量。取1.25 g刺五加不同部位样品，同时加入80%乙醇溶液50 mL放置于锥形瓶中，超声提取40 min制成供试品溶液，另外配置0.634 mg/mL芦丁对照品溶液。分别吸取刺五加不同部位供试品溶液1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，加入0.3 mL的5%亚硝酸钠，混匀静置6 min后加入0.3 mL的10%硝酸铝，混匀静置6 min后再加入4 mL的4%NaOH，用蒸馏水稀释至刻度，混匀放置12 min后，在512 nm波长下进行全波长扫描比色并记录吸光值，根据回归线方程Y=0.556 4X-0.01，R2=0.988 6（Y为吸光度，X为对照品浓度），计算出刺五加不同部位黄酮含量，公式如下：

式中，Y为吸光度值；M为供试品质量（mg）；A为稀释倍数；V为供试液体积（mL）。

1.4 重复性试验

取刺五加不同部位样品，平行3次取样用于制备供试品溶液，进行紫丁香苷、多糖及黄酮含量的测定，结果取平均值。

1.5 精密度试验

精密量取刺五加供试样品各5份，按照测定多糖和黄酮方法操作显色，测定吸光度值。

1.6 稳定性试验

分别取刺五加不同部位供试样品，按苯酚-浓硫酸和亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色方法显色后，每隔10 min测定一次吸光度并记录。

2 结果与分析

2.1 刺五加紫丁香苷含量

通过高效液相色谱法分别对刺五加的茎干、新枝和嫩叶3个部位的紫丁香苷含量进行测定。在相同的色谱分析条件下，紫丁香苷标品的出峰保留时间为8.38 min，峰面积为701.957 mAu·min（见图1A），其对应紫丁香苷浓度为8.383 mg/L。经测定分析，由色谱图1B~1D可见，刺五加的茎干、新枝和嫩叶在保留时间为8.30 min处均存在吸收峰，其对应峰面积分别为0.369、0.049和0.015 mAu·min，利用单点外标法计算刺五加的茎干、新枝和嫩叶中紫丁香苷浓度分别为0.004 4、0.000 59和0.000 18 mg/L，换算后得到刺五加茎干、新枝、嫩叶中紫丁香苷含量分别为0.001 8%、0.000 2%和0.000 1%，茎干中紫丁香苷含量最高，新枝次之，嫩叶含量最少，其中茎干分别高出新枝800%，高出嫩叶1 700%。从以上分析可知，子午岭刺五加紫丁香苷活性成分含量主要集中于茎干，体现出了其茎干较高的药用价值。子午岭保护区刺五加不同部位紫丁香苷含量为茎干＞新枝＞嫩叶，与刘芳芳［10］的研究结果相一致，刺五加紫丁香苷含量低于吉林省露水河、河北雾灵山国家级自然保护区和辽宁省本溪市［11］的紫丁香苷含量。曹建国等［12］发现刺五加新枝中紫丁香苷含量最高，平均达到2.94%，通过对比不同季节刺五加紫丁香苷含量发现刺五加中紫丁香苷由于产地不同，季节差异不同含量存在明显差异，春、秋季含量较高，夏季含量较低。不同地区刺五加紫丁香苷含量可能与周围环境、所处地理位置以及遗传学有关。张崇禧等［13］对刺五加不同采收期野生与仿生根、茎中紫丁香苷含量进行测定，结果发现刺五加野生根中紫丁香苷含量最多，平均达到0.204%。与其他地区相比较，子午岭保护区刺五加紫丁香苷含量仅处于较低水平。

图1 刺五加高效液相色谱图

2.2 刺五加多糖含量

分析刺五加茎干、新枝、茎韧皮和嫩叶4个部位的多糖含量，结果表明不同部位多糖含量差异较大。其中茎干中含量最高为7.53%，嫩叶中含量最少为3.43%，茎干含量约是嫩叶含量的2.2倍（见表1）。精密称取已知多糖含量的刺五加茎干粉末1.000 g，按照苯酚-浓硫酸显色法显色，精密度试验结果表明，测定平均值为7.53%，RSD=0.356 1%。稳定性试验经50 min内，吸光度基本趋于稳定，RSD=0.563 2%。

表1 刺五加不同部位多糖含量测定结果

子午岭保护区刺五加不同部位多糖含量茎干＞茎韧皮＞新枝＞嫩叶，这与程昆木等［14］研究结果相一致。茎干部位多糖平均含量最大为7.53%，由此可知，可首选刺五加茎干作为刺五加多糖类药品的提取原料。刺五加多糖含量在不同采集样地均不同，苇沙河、猫耳山及老岑界碑叶中总多糖平均含量分别为2.1%、1.8%和1.98%，吉林省临江市老岭基地刺五加叶柄部位平均多糖含量为5.07%，茎干部位平均多糖含量为4.21%，根皮部位平均多糖含量为1.75%，叶片部位平均多糖含量为0.417%［15］。李俊萍［8］选取了14个不同产地刺五加对其多糖含量进行测定，多糖含量最高的地区为黑龙江省七台河市勃利福兴林场（7.91%），多糖含量最低的地区为黑龙江省双鸭山市饶河大顶子山（4.26%）。孟繁磊等［16］研究表明，不同采样点刺五加多糖含量明显不同，对于同一采样点，采收时间的推迟也会导致多糖含量变化，多糖含量在6—8月呈上升趋势，9月份后开始下降。这也进一步说明不同采样地刺五加多糖含量均受湿度、温度、土壤条件、地理位置及光照时间的影响。子午岭保护区刺五加多糖含量与大多地区相比含量较大，处于较高分布水平。这得益于子午岭保护区大陆暖温带季风气候及1 000 m以上的平均海拔，为刺五加提供了适宜的生态环境。

2.3 刺五加黄酮含量

刺五加不同部位黄酮含量呈显著差异，如表3所示。其中嫩叶中含量最多为5.12%，茎韧皮含量最少为0.45%，嫩叶含量约是茎韧皮含量的11.38倍。准确称取已知黄酮含量的刺五加茎干粉末1.000 g，按照亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法显色，精密度试验结果表明，测定平均值为1.53%，RSD=0.364 8%。稳定性试验经50 min内，吸光度基本趋于稳定，RSD=0.535 8%。

表3 刺五加不同部位黄酮含量测定结果

子午岭保护区刺五加茎干、新枝、嫩叶中均含有黄酮类化合物，不同部位黄酮含量为嫩叶＞茎干＞新枝＞茎韧皮，这与代吉瑞等［9］研究一致。嫩叶部位黄酮平均含量最高为5.12%，与黑龙江省萝北县［17］和东北林业大学老山人工林试验站相比较高［18］。曹建国等［19］研究了3种不同生境下刺五加嫩叶的黄酮含量，发现不同生境下刺五加嫩叶中黄酮含量存在较大差异，其中林缘生境中的刺五加黄酮含量（2.9%）＞林隙生境中的刺五加黄酮含量（2.2%）＞林内生境中的刺五加黄酮含量（1.6%），均低于子午岭自然保护区刺五加嫩叶黄酮含量；吉林省露水河刺五加根、叶、果、茎干、新枝、茎韧皮及茎皮7个部位总黄酮含量分别是1.56%、5.46%、1.97%、1.41%、0.89%、0.59%和1.02%，与子午岭国家级自然保护区不同部位黄酮含量相当［10］。另有研究发现刺五加黄酮含量差异不但受采样地区影响，还受季节变化、温度的影响。黄酮含量会随着季节动态发生变化，5—8月期间呈逐渐降低的趋势，却在9月份有较大回转［19］。由于黄酮类物质具有多方面的药用功效，季节差异导致该地区黄酮含量变化的研究更有助于我们在合适的时机提取刺五加黄酮类药用活性成分。子午岭保护区刺五加黄酮含量与大多地区相比含量处于中等分布水平。因此，可首先选择刺五加嫩叶作为制造黄酮类药物的提取原料。本研究表明陕北刺五加嫩叶具有很好的黄酮类药物提取价值。

3 结论

陕北子午岭保护区刺五加不同提取部位其化学活性成分含量存在较大差异，紫丁香苷和多糖主要分布在植物茎干，黄酮主要分布在植物嫩叶。陕北子午岭保护区刺五加紫丁香苷、多糖和黄酮含量与其它地区相比，紫丁香苷处于较低水平，多糖处于较高分布水平，黄酮处于中等水平，多糖和黄酮具有较大开发价值，值得进一步深入研究。