溶血、脂肪血及保存条件对核酸检测的影响效果

王梅瑛

（青海省海西州中心血站 质管科，青海 海西 817099）

0 引言

核酸检测方法具有比较好的灵敏性，能够将病毒尽快检出，在血液检测工作中被推广使用[1-2]。下文探索溶血、脂肪血和保存条件对于核酸测定结果所形成的影响状况，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年6月-2020年3月血清学HBsAg、抗-HCV、抗-HIV测定结果都是阴性和血液相关病毒的核酸测定结果都是阴性的血浆标本归入项目指标分析样本资料。

1.2 方法

针对全部标本采集核酸HCV-RNA测定结果是阳性的血浆，制作12～30倍检出限浓度的对应核酸HCVRNA标本，收集血清学测定结果、血液相关病毒的核酸测定结果均为阴性的严重乳糜血浆标本以及红细胞悬液标本。

将以上红细胞悬液标本置于-60℃制备全溶血样本，针对全溶血标本予以倍比稀释处理得到不同血红蛋白指标的溶血标本，试验1A组血红蛋白指标是8.00g/L，试验1B组血红蛋白指标是5.00g/L，试验3B组血红蛋白指标是3.00g/L，各个组别分别有5份标本，血红蛋白指标检测选用氰化高铁血红蛋白测定方式，运用全自动细胞分析仪实施测定。

将以上严重乳糜血浆标本用作脂肪血标本，针对脂肪血标本添加予以倍比稀释处理得到不同甘油三酯指标的脂肪血标本，试验2A组甘油三酯指标是7.93mmol/L，试验2B组甘油三酯指标是3.80mmol/L，各个组别分别有5份标本，甘油三酯指标检测选用甘油磷酸氧化酶测定方式，运用全自动生化分析仪实施测定。

将以上12～30倍检出限浓度的对应核酸HCV RNA标本分别放于4℃温度下存储72h、4周及放于-20℃以下温度下存储72h、4周，分别用作试验3A组、试验3B组、试验3C组、试验3D组，各个组别分别有5份标本。

核酸HCV RNA指标选用全自动核酸提取以及扩增测定平台予以检测。

1.3 观察指标

评定血红蛋白指标、甘油三酯指标、存储温度、存储时长对核酸检测情况的干扰效果。

1.4 评定标准

核酸HCV-RNA阴性：标本未检出Ct值；核酸HCV-RNA阳性：标本检出Ct值[3]。

1.5 统计学分析

Ct值实行t检验，指标运用SPSS 23.0开展测定，P＜0.05，各项验证结果显示较大区别情况。

2 结果

2.1 血红蛋白指标对核酸检测情况的干扰效果

数值指标资料检测后，试验1A组Ct值对比于参照组涉及项目结果减小组间对比，具有统计学意义（P＜0.05），试验1B组、试验1C组Ct值对比于参照组涉及项目结果差距不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 血红蛋白指标对核酸检测情况的干扰效果

2.2 甘油三酯指标对核酸检测情况的干扰效果

数值指标资料检测后，试验2A组、试验2B组Ct值对比于参照组涉及项目结果差距不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表2。

表2 甘油三酯指标对核酸检测情况的干扰效果

2.3 存储温度、存储时长对核酸检测情况的干扰效果

数值指标资料检测后，试验3B组Ct值对比于参照组涉及项目结果加大组间对比，具有统计学意义（P＜0.05），试验3A组、试验3C组、试验3D组Ct值对比于参照组涉及项目结果差距不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

表3 存储温度、存储时长对核酸检测情况的干扰效果

3 讨论

当前，核酸检测方式在血液病毒检测中使用较为广泛。不过，核酸检测结果受到很多因素的影响，需要引起注意[4]。血液标本的收集、处置、存储等不适宜，可能促使病毒核酸出现降解现象，进而影响核酸检测结果[5]。

现阶段临床针对血液制品的检测一般利用核酸检测技术，能够实现病毒变异检测。同时，针对隐匿性感染有效检出。实际工作当中，血液标本会受到溶血、脂肪血、保存温度等不同因素影响，会引发核酸检测结果产生误差。核酸检测技术为1995年自欧洲血浆生产公司引入，逐步在血制品行业当中大力推广。近几年，将核酸检测技术引入到采供血机构当中实施血液筛查。2015年底，全国在供血机构逐步开展核酸检测技术筛查工作，采供血机构筛查逐步引入核酸检测技术的原因为核酸检测技术具备灵敏度高的特点，能够实现病毒窗口期缩短。

临床研究发现，通过核酸检测技术能够将乙肝病毒、艾滋病病毒、丙肝病毒的感染窗口期有效缩短。同时，采用核酸检测技术能够对于隐匿性感染及血清学漏检的血液有效检测。核酸检测应用在血液筛查中较为普遍，临床研究报道发现，美国从1999年利用核酸检测技术，艾滋病的残余风险低于百万分之一，乙肝病毒的残余风险逐步下降到1/20万。日本应用的采供血机构应用时间较早，并能够在血液筛查工作中有效实施。临床报道发现，日本乙肝病毒核酸阳性率一般为1/5.2万，丙肝病毒核酸检测率约为1/34.8万。艾滋病病毒为1/266.9万，我国采供血机构已经将无偿献血者血液全部实施核酸检测，大部分核酸检测筛查血清学阳性标本经过鉴定能够确定为HBV-DNA阳性，部分为采供血机构利用核酸检测筛查，其中检出能够处于窗口期感染的艾滋病病毒及丙肝病毒核酸血液标本。

传统血清学筛查能够最大程度地帮助患者降低经输血、血液制品引发的感染病毒风险，但尚未全部消除。现阶段，临床针对血液制品当中的可传染性病毒筛查明显具备更高标准要求，能够全面推动核酸检测技术发展，然而，实际核酸检测技术工作中，许多标本因素仍然能够对核酸检测技术产生一定影响，例如脂肪血、溶血等。如红细胞产生破碎后其中会大量释放Hb，其中核酸检测试剂属于抑制物，当中的细胞破碎后RNA酶会逐步释放RNA，会对核酸检测技术的灵敏度产生较大影响。日常工作中的标本溶血存在较多原因，其中部分标本留取过程中的外部机械会产生较多作用，使血液当中的红细胞破裂，如其中的标本留取不畅、留取速度过快等原因。部分剧烈震荡同样会产生标本溶血，血液标本会在运输过程中发生颠簸。

标本溶血当中具备一个不可忽视的因素即为脂肪血。伴随临床医疗技术不断发展，人们生活水平显著提高，由于摄入油脂类过多会导致采供血机构中少部分无偿捐献的血液进行分离后其中的上层血浆并非透亮，血浆外观会表现出浑浊乳白色。临床报道显示，高脂血标本能够通过荧光屏蔽、吸收对于检测结果产生干扰，血脂因素会引发荧光淬灭，引发患者产生荧光信号强度降低。同时，利用的不同检测试剂、系统中的实验室检测条件会导致检测结果略有不同，因此，脂肪血因素是否会对于患者的实验室核酸检测技术造成影响应进一步验证。

检测过程中，标本的质量（例如，凝血标本、溶血标本、运输、保存条件等）会对检测结果准确性产生直接影响。国外临床研究报道发现，利用煮沸裂解法实施标准处理，对于DNA纯化法出得的浓度低于两个数量级，同时，标本检测过程中的核酸降解同样为影响核酸检测结果的重要因素。例如，细胞破碎过程中，其细胞内的核糖核酸酶会大量释放RNA酶，降解对核酸试剂检测灵敏度产生影响，进而构成原始HCV、HIV，主要为双股正链RNA及单股正链RNA，容易受到RNA降解酶的影响。对标本的保存研究中发现，标本的不良保存会引发病毒核酸检测阳性率降低，针对标本实施定量分析，发现HCV-RNA可在4℃下保存五周以上，如标本处理、采集不当会引发病毒降解，对核酸检测技术的灵敏度产生影响，不利于输血安全。因此，核酸试剂厂家说明书中提出标本处理的有效指导意见，每个实验室标本在运输、采集及储存过程中条件存在差异，获得的标本质量存在不同。因此，核酸检测技术的标本正确采集和保存处理关键环节可确保该地区的高质量、高效实现核酸检测技术工作指导，能够降低HBV、HIV、HCV经血液传播风险。因此，在选择适宜的红细胞制备溶血样本考量标准主要为血清学检测阴性、上清外观透亮、病毒核酸检测为阴性；高浓度脂肪血标本主要考量的标准为外观透亮、存在单一核酸病毒阳性、病毒浓度适宜。

这次调查所得指标样本内容中，血红蛋白指标8.00g/L的溶血标本Ct值降低，而血红蛋白指标是5.00g/L、3.00g/L的溶血标本Ct值无明显改变。血红蛋白能够影响Taq酶的生物活性，对聚合酶链式反应检测结果带来干扰。本文表明，甘油三酯指标是7.93mmol/L、3.80mmol/L的脂肪血标本Ct值无明显改变[6]。高浓度甘油三酯对核酸检测结果无显著影响，故高血脂标本原则上能够接收。该文得到的指标内容显示，4℃温度下存储4周的标本Ct值升高，而4℃温度下存储72h及-20℃以下温度下存储72h、4周的标本Ct值无明显改变。实施核酸检测时需收集血液72h内尽早予以测定，规避核酸降解，若难以尽快检测，需将血浆存储于-20℃以下温度暂时保存[7-8]。

综上所述，溶血、脂肪血、不同保存条件都有可能会影响核酸测定结果，建议溶血标本中血红蛋白指标在8.00g/L以上则需重新采集标本，脂肪血标本中甘油三酯指标需维持7.93mmol/L以下才可接收，采集标本72h内尽快实行核酸测定，针对不能尽快送去核酸检测的标本需分离血浆放于-20℃以下温度下存储。