桃叶蓼白粉菌的显微观察及进化关系分析

孙 博，刘 闰，王占斌，陈黄欣，阎 肃

（东北林业大学林学院，哈尔滨 150040）

0 引言

桃叶蓼(Polygonum persicariaL.)是一年生的草本植物，在植物分类学上属于蓼科(Polygonaceae)蓼属(PolygonumL.)，桃叶蓼广泛分布于中国各地，如东北（黑龙江、吉林、辽宁）、华北、华南等地，多在夏季6—9月开花，开花后一个月结果。桃叶蓼是一种药用草本植物，全草可入药，具有祛除湿气，助消化，除肠道寄生虫的功效，还可用于治疗感冒，腹泻等。桃叶蓼白粉病是桃叶蓼一种常见的病害，在生长期几乎每年都普遍发生。桃叶蓼白粉病具有发病时间短，流行速度快的特点，在阴雨和高湿的条件下适宜发生[1]。叶片叶柄均可发病，中下部叶片先发病，逐渐向上部叶片蔓延[2]，起初叶片会产生细小、淡白色的病斑，后逐渐扩大成灰白色粉末状，严重时会覆盖整个叶片[3]，对桃叶蓼的生长发育造成严重影响。因此期望能通过本实验对菌种的分类鉴定为桃叶蓼白粉病的防治提供依据。

桃叶蓼白粉病原菌在菌物分类学上分属于叉丝壳属，而叉丝壳属是白粉菌中其中一个重要的属。1851年，法国人J.H.Leveille建立此属，迄今为止全世界共报道约70余种。中国叉丝壳属的种比较多，根据郑儒永等人主编的《中国真菌志》第一卷记载有41个种和变种，寄生在19科34属植物上[4-5]。目前关于桃叶蓼白粉病的相关研究在国内外都比较少见，在国外可见少量的关于近似物种萹蓄(Polygonum aviculare)的研究报道，国内仅有王伟等[6]曾对萹蓄白粉病进行过专项研究报道，但其病原菌的报道最早可以追溯到1913年[7]。

一般情况下，白粉病病原鉴定工作主要是根据病原菌无性阶段形态特征、分生孢子萌发方式和有性阶段闭囊壳的显微观察差异判断[8]，但因为其无性阶段形态差异较小，有性阶段的闭囊壳也不是一直能够观察到，所以分类鉴定工作一直相对困难。近年来随着分子生物学的迅速发展，rDNA转录内间隔区(internal transcribedspacer，ITS)和28S rDNA D1/D2区已被广泛应用于菌物分类鉴定、系统发育和亲缘关系等研究[9]。为了明确桃叶蓼白粉病病原种类及其分类地位，本文将通过对形态学和分子生物学方法对病原进行鉴定和分类[10]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

白粉菌样本(TL190501)于2018年05月13日采自黑龙江省哈尔滨市外滩湿地生态公园，寄主植物为桃叶蓼(Polygonum persicariaL.)。提取白粉菌基因组DNA的试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白粉菌形态学观察 用刀片轻轻刮或解剖针挑取桃叶蓼叶片表面的白色菌丝及分生孢子、闭囊壳制成临时玻片，光学显微镜观察分生孢子、子囊孢子大小、形状，闭囊壳大小、形状，附属丝的相关特征。如病原菌不能很好地展开则轻轻敲击盖玻片，使得闭囊壳开裂释放其内部的子囊以及子囊孢子，统计其内部的子囊以及子囊孢子数量、形态、大小并记录观察相关数据。

1.2.2 基因组DNA的提取 本实验对桃叶蓼白粉菌基因组DNA提取采用试剂盒法。（1）首先取一定量的桃叶蓼白粉菌菌丝体（注意不要有其他杂菌的菌丝及子实体），加入液氮后进行充分研磨，将研磨得到的真菌粉末装入1.5 mL离心管中；（2）加入400 μL缓冲液FP1至离心管中，6 μL的RnaseA(10 mg/mL)，置入旋涡震动机中震荡1 min，室温放置时间为10 min；（3）离心管中加入130 μL缓冲液FP2，置入旋涡震荡机旋涡振荡1 min，再置入离心机12000 r/min条件下离心5 min，弃沉淀，上清液转移，这一步骤重复2次；（4）然后加入0.7倍体积的异丙醇（约350 μL）至盛有上清液的离心管中，上下摇动充分混匀，约30 s后会出现絮状的基因组DNA悬浮物，将离心管置入离心机中12000 r/min离心2 min，弃掉上清液，保留沉淀；（5）加入70%乙醇700 μL，置入旋涡震荡机中振荡5 s混匀，随后置入离心机12000 r/min离心2 min，弃掉上清，将这一步骤重复；（6）开盖倒置盛有沉淀物的离心管，在室温下晾干10 min，使乙醇彻底挥发；（7）在晾干后的盛有沉淀物的离心管中加入适量的洗脱缓冲溶液TE，置于水浴锅中65℃水浴45 min使DNA溶解，期间每隔5 min需要颠倒离心管混匀数次助溶，最终获得DNA溶液。将该DNA溶液利用琼脂糖凝胶电泳的方法检测后保存备用。

1.2.3 ITS序列PCR扩增 实验采用的引物序列为：通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')及ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，通过扩增桃叶蓼白粉菌rDNA获得的目的DNA片段，PCR扩增反应采用PCRMix试剂。反应体系50 μL如下：2 μL模板DNA；PCRMix24μL；ddH2O20μL；P1和P2分别为2μL。PCR扩增的条件如下：94℃预变性2 min；94℃变性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸2 min；共30次的循环；72℃最终需要延伸10 min。PCR结束对得到的扩增产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭(EB)染色观察后，对检测合格的样品进行下一步序列测定和分析[3]。

1.2.4 序列分析 将获得DNA序列输入GenBank并进行BLAST比对检索，采用Clustalx l.83将测序得到的白粉菌结果与从NCBI数据库中抽取得到的22种白粉菌的ITS序列构建系统发育树并推理系统进化关系。

2 结果与分析

2.1 桃叶蓼白粉菌形态检测

桃叶蓼白粉菌的菌丝体生于桃叶蓼叶正反两面，多数生于叶片正面，少数生于叶片背面，存留至近存留，菌体在桃叶蓼叶面形成厚或薄的白色病斑，随着病发严重最后铺满全叶，通常在病害后期子囊果成熟以后菌丝体会消失；分生孢子呈柱形，(26.5-)30.4 ～42.9(-55.3)×(12.9-)14.2 ～16.9(-19.1)μm；萌发形成附着胞的顶端膨大（图1-3）。子囊果呈暗褐色，多数聚生或者近聚生，极少数散生，多呈扁球形，少数球形，直径(87-)94 ～121(-141)μm，有不规则的多角形壁细胞，壳壁细胞直径6.5 ～16.8(-21.3)μm；附属丝(8-)12 ～37(-47)根，多见16根，不分枝或不规则分枝，少数顶端近双叉状分枝1 ～2次，直或弯曲，常作扭曲状或曲折状，长度约为子囊果直径的(0.3-)0.5 ～1(-1.6)倍，长(31-)76 ～159(-211)μm，多见局部粗细不匀或上下近等粗，宽(3.8-)5.1 ～8.9(-10.6)μm，附属丝薄壁，多平滑，有少数较粗糙，附属丝内有隔膜0 ～3个，根部为褐色，向上渐淡至近无色；子囊4 ～8个，多数呈各种不规则卵形，少数近球形，部分有明显的柄，少数无柄，(45.8-)51.3 ～72.1(-91.1)×(31.5-)32.0 ～45.8(-51.1)μm；子囊孢子2 ～4个，多见椭圆形，少数为矩圆形，略带淡黄色，(16.5-)19.3 ～31.2(-34.2)×(10.2-)11.7 ～16.2(-17.6)μm。

图1 桃叶蓼叶面上白粉菌分生孢子(20×60)

图2 载玻片水滴中显微观察桃叶蓼白粉菌分生孢子(20×60)

图3 桃叶蓼叶片白粉菌分生孢子萌发形成附着胞(20×60)

2.2 桃叶蓼白粉菌进化关系分析

2.2.1 提取桃叶蓼白粉菌基因组DNA及PCR的扩增结果 实验扩增桃叶蓼白粉菌rDNA获得目的DNA片段，用胶回收试剂盒回收并纯化，电泳检测所得结果，回收PCR扩增产物后测序，测序结果获得碱基序列长度为642 bp，结果如下：TTCCCGTAATGCCGAGGC TTCATTCGTGGCGTCTGCGGCGTGCTGGGCCGAC CCTCCCACCCGTGTCGATTTGTATCTTGTTGCTT TGGCGGGCCGGGCTACGTCGTCGCTGTCCGCAG GGACACGCGTCGGCCGCCCACCGGTTTCGACTG GAGCGCGCCCGCCAAAGACCCAACCAAAACTCA TGTTGTCTGTGTCGTCTTAGCTTTATAATGAAAAT TGATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCT GGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA GTAATGTGAATTGCAGAATTTAGTGAATCATCGA ATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCC GAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATAACACCCC CTCCAGCTGCCGTTGTGTGGCTGCGGTGTTGGGG CTCGTCGCGAAGCGGCGGCCCTTAAAGACAGTG GCGGTCCCGACGTGGGCTCTACGCGTAGTAACTT GCTTCTCGCGACAGAGTGACGCCTGGTGGCTTG CCAGAACAACCCCTATTGGGTCCAGTCACATGGA TCACAGGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCC GCTGAACTTAAGCATATCAATAGCCGGGAGGAAA A。

2.2.2 桃叶蓼白粉菌ITS序列进化树构建结果与分析从Genebank中选取25种植物白粉菌ITS序列（表1），使用MAGA 5.05软件根据邻近距离法构建系统发育树推演进化关系与本实验结果进行分析比较。

表1 用于同源性比较分析的白粉菌

将本实验测序结果与部分选取植物白粉菌ITS序列进行比较分析（表1）。对表1白粉菌的ITS序列对比分析结果见图4。

图4 26种白粉菌序列的比对分析

用MEGA5.05软件分析处理26种白粉菌，完成构建系统发育树（图5）。

图5 基于ITS序列构建的系统发育树

根据基因进化树和碱基序列比对图表可见，进化树有2个较大的分支，相同种属植物的白粉菌聚为统一进化枝，如桃叶蓼白粉菌(TL190501)的ITS序列与阿塞拜疆萹蓄上的Erysiphe polygoni(LC328323.1)、美国新变种直立萹蓄上的Erysiphe buhrii(KX826856.1)等6种植物上的白粉菌有比较高的相似度，碱基序列相似度可达99%，亲缘关系极近；与韩国莳萝上的Erysiphe heraclei(JX499184.1)、韩国欧芹上的Erysiphe heracleid(KF680162.1)及韩国山萝卜上的Erysiphe heraclei(KF111807.1)等6种植物白粉菌在亲缘关系上比较接近，碱基序列相似度约97%；与巴西大豆上的Erysiphe diffusa(AY739112.2)及中国紫藤上的Erysiphe diffusa(KM260363.1)亲缘关系比较接近，碱基序列相似度约为95.59%；与美国豌豆上的Erysiphe pisi(FJ378868.1及FJ378871.1)相似度比较低，碱基序列相似度约为94.95%；与法国橡树上的Erysiphe alphitoides(EF672350.1)及中国大叶杨上的Erysiphesp.(HQ012432.1)亲缘关系较远，碱基相似度为94%；与美国鳄梨上的Erysiphesp.(MF577080.1)之间相似度较低，它们碱基序列相似度为94.27%；与日本大叶柳上的Erysiphe adunca(LC028970.1)相似度最低，碱基序列相似度仅为92.25%。

根据碱基序列比对图可看出，桃叶蓼白粉菌(TL190501)与阿塞拜疆萹蓄上的Erysiphe polygoni(LC328322.1及LC328323.1)仅仅在第13位上有所不同，桃叶蓼白粉菌第13位碱基为G，而阿塞拜疆萹蓄(LC328323.1)白粉菌为T，因此可以初步判定两种白粉菌为同种同属白粉菌；与韩国莳萝上及韩国山萝卜的Erysiphe heraclei（JN603995.1及KF111807.1）在第13、79、97、98、105、164、204、428、460、542位碱基不同，亲缘关系比较接近；与印度罗勒上的Erysiphe Pseudoidiumsp.（AY739112.1）在第13、78、79、82、83、86、89、98、105、119、122、126、130等很多碱基上有所不同；与日本大叶柳(LC028970.1)上的Erysiphe adunca在第 4、7、9、13、18、19、24、31、32、44、47、51、53、54、56等较多碱基上有所不同，可见两种白粉菌亲缘关系较桃叶蓼白粉菌与阿塞拜疆萹蓄亲缘关系较远。而26种植物白粉菌的碱基序列在211 ～378 bp区间内保持着高度的一致性，因此可初步判断这部分碱基序列可能对白粉菌性状稳定遗传这一功能起着保障作用。

3 讨论

传统菌物分类学有关白粉菌的分类在白粉菌科(Erysiphaceae)内属的划分主要是根据形态（无性世代和有性世代）来进行的，如真菌分生孢子的形状、数量多少，孢子的大小以及着生的方式，一个闭囊壳内有多少子囊以及所含有的子囊孢子数量等，其他一些重要特征如闭囊壳外所具有附属丝的形态特征等也是分类的重要依据。目前随着科学技术的发展，已经发现原有的分类方法与分类系统具有一定的缺陷[11-15]。如钩丝壳属(Uncinula)、半内生钩丝壳属(Pleochaeta)和叉钩丝壳属(Sawadaea)，在它们的顶端附属丝类型都呈现钩状卷曲，但实际上它们的差别却比较大。节丝壳属(Arthrocladiella)和叉丝壳属(Microsphaera)二者都具有二叉状分枝，实际上它们的无性世代根本不同，前者分生孢子的着生方式为单生，后者分生孢子的着生方式为串生。

近年来，随着科学技术的快速发展，如分子生物学相关技术手段的应用，微生物的分类可以更多地采用一些先进的技术，使科学家们可以对白粉菌研究关注其系统分类学的关系[16-18]。微生物学家对菌物分类的研究目前不仅仅局限在形态分类上面，目前对白粉病菌的鉴定研究扩展了白粉菌的种类及其寄主范围。分子生物学方法在病原物的鉴定上具有很多的优点和可靠性，在对病原菌物分类及鉴定时，一些国际上通用的大型数据库如GenBank等非常多的生物学信息可作为物种鉴定重要的参考来源，从而使微生物的分类能够更加地准确、有效。因此通过显微观察结合分子分类方法的应用在真菌的分类学上就超来越受到重视[19-20]。

为了减少因为传统分类方法造成的误差，本研究结合了分子生物学方法对桃叶蓼白粉菌进行进化分析，并通过构建桃叶蓼白粉菌系统发育树，为该病原菌的研究提供了有价值的信息。目前国内外的研究中，对桃叶蓼的研究几乎没有，通过本实验可以初步判定桃叶蓼白粉病的病原菌，并通过序列比对分析找到亲缘关系接近的菌种，未来将参考由其同种同属病原菌侵染发生的其他白粉病的防治方法，为桃叶蓼白粉病寻找系统的防治措施。

4 结论

实验中通过显微观察到桃叶蓼白粉菌分生孢子呈柱形；子囊果呈暗褐色，多数聚生或者近聚生，多呈扁球形；子囊4 ～8个，多数呈各种不规则卵形，其中多含2 ～4个椭圆形子囊孢子，可以判断桃叶蓼白粉病病原菌属于叉丝壳属，再结合序列比对分析确定该菌种与GenBank中的Polygonum aviculare（登录号为LC328322.1）、Polygonumerectum（登录号为KX826856.1）之间的亲缘关系最为接近，碱基序列相似度值达到99%，可以明确其病原菌与萹蓄为同种同属。本研究将为桃叶蓼白粉病的鉴定提供合理的依据，也为桃叶蓼白粉病的防治提供方向和理论基础。