丛枝菌根(AM)真菌扩培技术研究进展

李少杰，肖清山，宋福强，王 歆

（1黑龙江大学生命科学学院，农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔 滨150500；2黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室，哈尔滨 150080；3黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室，哈尔滨 150080）

0 引言

丛枝菌根(arbuscular mycorrhizas，AM)是一种广泛存在于陆生植物与AM真菌间的共生体，共生体模式可以为双方提供更为理想的营养条件，AM真菌可以从植物中获取碳源、脂类等重要营养物质；植物则可以通过真菌菌丝增加土壤中养分的吸收来促进植物的生长发育并提高植物体的抗逆性，因而有利于彼此各自生长[1]。丛枝菌根的相关研究不仅对共生机制的深入了解具有重要意义，同时也对其在农业发展[2]和生态修复[3]的应用上具有重要作用。

AM真菌-植物共生体系的研究涵盖了AM菌根形态、功能、共生机制以及应用等诸多方面。在这些研究中，AM真菌的作用都是至关重要的，因而对其进行培养则成为基础研究和应用工作的前提。迄今为止，虽有研究表明AM真菌有能力在没有植物共生的情况下萌发菌丝，但还无法像其他种类真菌一样在培养基上纯培养，这一问题极大地限制了对AM真菌的基础研究和广泛应用[4]。尽管如此，仍然有不同的基于共生培养的技术方法被先后建立起来，并被应用于不同研究目标的AM真菌扩培，如土壤盆栽法、AM真菌-植物根系离体培养等，其中AM真菌-转化根共生培养技术的应用推动了一些重要的研究结论的获得[5]。另一方面，现有培养体系和技术仍存在不足，难以实现简便高效的AM真菌大规模培养。可以预见，AM真菌培养技术的突破将是阐明其共生机制和菌剂成功应用的决定因素，故本文对AM真菌扩培技术的发展情况进行梳理和总结，重点对AM真菌转化根系共生培养方法进行了介绍，并展望了相关研究的后续发展，期望对今后的培养技术发展提供理论依据和技术参考。

1 AM真菌与完整植物体共生培养

丛枝菌根是植物根系与AM真菌形成的共生体，在植物根系与其他器官无需分离的条件下，完整植物体生长过程中与AM真菌形成共生状态是简单有效的AM真菌扩培技术途径。

1.1 植物土壤盆栽法(Pot culture method)

植物土壤盆栽法是将AM真菌的繁殖体接种到含有完整植物的土壤盆栽中以获得大量AM真菌[6]。菌根体系进化发展一直是在植物根系和AM真菌的相互作用下进行的，这一过程的典型环境就是土壤。因此该方法是目前为止AM真菌扩繁、获得生物菌剂最为稳定有效的方法。然而盆栽培养法也有其明显的不足，首先植物根系土壤微生物种类繁多，环境复杂，干扰严重，尽管可以利用盆栽和土壤灭菌方式控制土壤中微生物的存在和生长，但依旧是极易引起污染，不利于机制研究的开展。其次从应用层面来看，AM真菌的培养过程较长、产生的繁殖体数量少，并且该方法涉及大量土壤的采集、保存、投放，占用了大量空间，不方便运输与携带。

1.2 营养液膜法(Nutrient film technique)

营养液膜法[7]原本用于植物的无土栽培，在植物相关研究中被推广应用，主要包括了静止营养液培养和流动营养液培养。该方法是将植物种植在浅层营养液中，使植株根系直接在槽中生长。在此植物培养的基础之上，可以建立AM真菌与植物根系的共生体系。虽然该方法可以有效避免土壤中微生物的污染，但植物根系长期浸泡在营养液中，不利于根系与真菌的呼吸，对AM真菌的繁殖有较大的影响，如果根系环境控制不当也易引起营养失调和根系死亡。该方法虽克服了土壤培养中复杂微生物影响的弊端，但根系所在营养液的环境限制了AM真菌共生的形成，难以实现AM真菌大量培养法，使用中具有极大局限性。

1.3 汽雾栽培法(Aeroponics)

汽雾栽培法也是一种植物无土栽培方法，它是利用喷雾装置将营养液雾化为小雾滴状，直接喷射到植物根系以提供植物生长所需的水分和养分的一种无土栽培技术[8]。该培养方法需要容纳根系的密闭栽培装置以及自动喷雾装置，相对较为复杂，在AM真菌扩培方面实际应用的报道不多，不具有很强代表性。

1.4 培养基培养法(Medium culture)

1962年，Mosse首先提出了在无菌条件下人工建立AM真菌的培养体系[9]。培养基培养法是将宿主植物种子进行表面消毒处理，接种在琼脂培养基上使其发芽，当种子出芽并产生侧根后，将表面消毒好的AM真菌孢子接种在侧根附近的培养基上，在温室条件下进行培养。该方法仍然保留植物的完整植株结构，只是将根部置于培养皿中培养，其余的茎叶部分置于无菌封闭装置内生长培养[10]。当AM真菌与植物根系建立共生关系并大量繁殖时，即实现了AM真菌的培养基培养。

以上总结了AM真菌研究过程中早期形成的各种培养方法，这些方法均建立在AM真菌与完整植物体共生基础之上，其共生具体实现策略各不相同，适合于不同研究目的培养需要。其中，最重要的方法仍然是植物土壤盆栽法，其保持了AM真菌最本源的生长状态，不仅是最可靠的AM真菌的扩培方式，而且是获得广泛的不同种类的AM真菌的唯一途径和根本保证。其他方法都在不同层面上有所创新，使其可在一定程度内避免其他微生物的干扰，在一定程度上克服了以AM真菌培养作为研究技术手段的障碍，对于后续培养方法的产生具有推动作用。

2 AM真菌与植物根系双重培养

在丛枝菌根共生体中，AM真菌生长所依托的物质能量来源是植物根系，如果可以把植物根系独立于植物体进行培养，就可能建立一个新的简单的共生培养体系。植物体所具有的组织培养特性提示该方法是可以实现的，正是基于这种理念，植物根系单独与AM真菌共培养体系的建立一度成为研究热点。

2.1 原生根培养(Non-transformed root culture)

Mosse不仅率先提出了在无菌条件下人工建立AM真菌培养体系，同时也实现了离体植物根系的AM真菌共生培养技术[11]。研究报道显示，目前已经有以若干种类植物根系为基础的AM真菌体外培养的体系被成功建立。然而在缺少茎、叶等器官支持下，植物原生根系的离体生长状况并不理想，根系的充分生长以及大量次生侧根的形成均比较困难，因此该AM真菌的体外培养方法效率受到了较大的限制。依赖植物原生根系离体培养而建立的AM真菌体外培养体系的具体情况见表1。

表1 原生根AM真菌培养体系

从表1可以看出，AM真菌的囊泡结构也可以作为其扩繁的初始材料[20]。同时，培养前根系需要进行充分的无菌处理并需保持生长能力，其实践的难度相对较大，既有的研究报道中采用比例较低。与之相对应的是，原始根系与AM真菌共生研究中，更多的是AM真菌和植物根系分别独自进行前期处理，而后再进行共生培养。同时可以发现，在成功建立共生体系的研究结果中，所有原始根系与AM真菌均采取单室培养模式，即二者共处于一个培养空间，并且所采用的AM真菌和共生植物也相对集中于少数种类之间。尽管上述所有研究中AM真菌孢子产量均相对较低，植物根系生长状态也不理想，但其相较之前的培养方法是一种突破。该方法可避免完整植物体的存在、可以显著压缩培养物体积、简化操作过程，对后续转化根技术应用提供有效的技术支持。

2.2 转化根培养(Transformed root culture)

在离体根培养的基础之上，20世纪80年代以来建立的AM真菌与转化根双重培养体系成为了培养AM真菌的有效方法[21]。该方法基本过程是：首先利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)中的Ri T-DNA侵入植物并整合到基因组中而使各种植物组织长出大量的转化根，也被称为毛状根(hairy root)[22]；毛状根在经过多次选择培养之后置于固体培养基中，将表面消毒并萌发的AM真菌孢子也接种到该培养基上，进而AM真菌菌丝侵染根系形成AM菌根共生体系。此方法关键之处：一是获得的转化根系的质量。转化根系能否持续分生出侧枝是获得成功的关键，这涉及到农杆菌菌株类型和植物间适合性以及农杆菌最佳诱导条件问题；二是AM真菌孢子无菌处理的条件和萌发效果。过强的处理条件对杂菌的杀灭固然有利，但会影响AM真菌孢子的萌发，而弱的处理方法则造成杂菌的大量生长污染，需要寻找到其中的平衡点及弱的消毒剂（如氯胺T）相对长时间处理（20 min左右），保证多数孢子后续培养中没有杂菌污染为最适合条件。AM真菌孢子萌发的条件和影响因素也较多，普遍认为最初阶段不需要特殊营养条件，也可能存在一些抑制因素，AM真菌不同种属间也存在一些差异。

在该方法体系中，由于转化根基因组中整合了农杆菌的毒性基因，其能够在适合的培养基中且没有植物激素的前提下快速生长，可以在短期内获得大量分生转化根，极大增强了AM真菌培养的简便性。基于植物转化根AM真菌培养体系的建立，开创了AM真菌培养研究的新技术方法体系，极大推动了AM真菌体外培养的发展，多种植物和AM真菌间因此实现了体外共生培养（表2），其中根据所采取的具体培养方式又可以分为单室培养和双室培养。

表2 转化根AM真菌培养体系

续表2

2.2.1 单室培养(mono-compartmental system)单室培养皿方法首先于20世纪70年代中期被应用于AM真菌培养[11]，随后便成功在多种AM真菌种类的培养中获得成功（表2）。简单而言，该方法是在培养皿中置于适合的植物培养基，在其上放置转化植物根系，然后将经灭菌处理的AM真菌接种于根系周围进行共培养并完成侵染与共生。该方法相对于原始根系共生培养无论在成功的概率还是后续次生孢子的产量上均具有显著性提升，使得此类方法培养AM真菌开始具有实践意义，而不仅仅停留在象征意义上。尽管如此，该培养方法的AM真菌孢子产量依旧难以满足应用需求，而且整个培养周期也相对较长，技术上仍然需要进一步完善。

2.2.2 双室培养(bi-compartmental system)双室培养是使用被中间隔断为两部分的培养皿进行AM真菌的培养。其中一侧AM真菌和培养根系共生（菌根室）；而另外一侧则只有菌丝可以逾越间隔进入并生长（菌丝室）[28]。两侧培养基成分基本相同，唯一区别是菌丝生长一侧加入可作为碳源的蔗糖。实践证明，该培养方法可以显著提高AM真菌孢子的产量，特别是不断置换菌丝室培养基并在菌根室补充葡萄糖的措施下，这一提高程度非常显著。

培养基转化根培养与植物常规生长土壤条件以及AM真菌共生环境是有本质差别的，这被认为会引起AM真菌和根系共生过程中的非典型变化[53]。因而，最新的研究也出现双室培养中把菌丝生长侧的琼脂培养基替换为过筛灭菌土壤的培养方式[32]，其在AM真菌孢子产量和共生性状上被认为有实质影响。

3 展望

丛枝菌根的相关研究已经持续进行了几十年，研究的重点大致集中于理论和实践两个层面。理论层面上，AM真菌和植物根系共生体的机制仍不清楚，AM真菌高效培养方法的相关研究有助于进一步阐明菌根共生机制乃至补充共生理论。实践层面上，AM真菌和菌根的研究有助于AM菌剂生物肥料的应用开发，对于增强农作物营养、促进生长、抗逆性、抗病虫能力等意义重大。更为重要的是，传统肥料和农药的使用会造成严重的环境问题，相对而言，AM菌剂生物肥料的优势尤为明显。

AM真菌的培养技术无论对于共生机制研究还是应用研究都是关键因素。目前看来，纯培养的目标在短期内还难以实现，但基于既有的AM真菌培养体系和研究方法，特别是AM真菌-转化根共生技术，已经逐步取得了一些重要的菌根形成分子机制的研究进展。其中包括AM真菌和植物根系间信号传递的主要效应分子和途径，以及AM真菌进入根细胞和丛枝结构形成的过程。尽管整体过程详细机制仍不清楚，其中涉及到的众多植物功能因子的作用还不确定，不同植物宿主种类研究结果也不完全一致，但这些结果对于后续研究仍然非常重要。另一方面，对于AM真菌与植物共生需求最初的认识是通过共生关系从植物体获得重要的碳源物质满足生长需求，后来的研究发现更重要的需求是脂类物质[54]。由此可见，AM真菌的纯培养和共生机制阐明是一个问题的两个表象，通过新的技术体系，如果实现了纯培养，则为什么AM真菌需要和植物根系共生的问题就可以得到解决；同样，如果通过新的方法研究明确了AM真菌和和植物根系共生的根本原因，则可以通过不同手段弥补此类需求而实现单独纯培养。

鉴于目前无法实现AM真菌的纯培养，现阶段通过共生培养体系研究获得研究结果就成为唯一的途径，后续的相关研究重点应包括以下几个方面：

（1）AM真菌-根系共生体形成的详细机制，包括AM真菌和植物根系间信号传递的方式以及信号反馈的功能因子和具体机制等相关研究。有研究表明不同类型共生体间存在一定的相似性，例如：根瘤共生体与AM菌根在信号传递通路方面有明显的一致性[55]；印度梨形孢(Piriformospora indica)作为和AM真菌类似的真菌种类，也能与植物根系形成共生体，但其可以实现单独纯培养，相较于AM真菌存在较大的差异。通过比较研究AM真菌与根瘤菌或印度梨形孢的相似及差异性来进一步揭示共生机制是一种可能的解决问题的途径。

（2）现有研究结果基础上进一步探究并利用促进AM真菌孢子生长的机制和策略。例如：进一步明确脂肪酸[56]对于AM真菌生长和共生体形成中重要作用的机制；丛枝菌根形成中植物限制AM真菌侵染的负调控机制的详细过程和影响因素等。通过类似策略的应用来提高AM真菌培养孢子产量，乃至实现AM真菌的完全纯培养，以及AM真菌生物肥料的高效应用。

（3）探寻新的AM真菌的培养方法。纵观AM真菌的培养方法发展历程，机制研究取得的重要结果都是建立在转化根-AM真菌共生培养之上的，尽管体系中仍然有植物根系存在，但相较于之前的方法体现了简便性、高效性和纯净性，具有重要的进步意义。今后新的研究进展很大程度上依赖新的培养技术方法，而能继续形成技术突破的培养方法一定是与以往方法存在明显不同的，例如转化根的应用与原始根共生培养之间，表面看到的培养方式、流程等均没有明显差异，但转化根由于其特殊增殖性与原始根性质截然不同。因此，未来能够对AM真菌研究带来变革的方法体系需要不断有新技术的加持。