广东3个地方鸡种mtDNA D-loop全序列的遗传多样性分析

李 莹，舒鼎铭，何静怡，罗威，王艳，陈鹏，蔡曼珊，刘天飞，计坚，罗成龙

（畜禽育种国家重点实验室&广东省畜禽育种与营养研究重点实验室&广东省动物育种与营养公共实验室&广东省农业科学院动物科学研究所，广东广州 510640）

广东地处我国南部，拥有丰富的光、热、水资源。受广东特殊气候及“无鸡不成宴”等习俗的影响，形成了丰富的地方鸡种资源，如清远麻鸡、惠阳胡须鸡、阳山鸡等。近年来，部分地方鸡种资源得到了开发利用，但也存在种质资源混杂的问题。

了解鸡种遗传资源状况及其亲缘关系是有效保护及利用的前提。线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）结构简单、进化速率快、无组织特异性，其多态分析是研究种间或种内遗传多样性和进化关系的有效途径之一。目前，国内外学者针对不同鸡种mtDNA开展了大量研究，2020 年Ahmed 等利用mtDNA D-loop 区序列分析了706个来自中东、北非和非洲之角的本土家鸡的遗传多样性。同年，Ayano 等利用mtDNA D-loop 序列和54个微卫星DNA 标记对日本国家生物资源中登记的21个试验鸡品系的遗传特性和多样性进行了检测。NCBI 收录了黄郎鸡、桃园鸡、雪峰乌骨鸡、大围山微型鸡、金湖乌骨鸡、如皋鸡、狼山鸡、溧阳鸡、太湖鸡、略阳鸡、丝羽乌骨鸡、卢氏鸡和儋州鸡等中国地方鸡种mtDNA全序列以及大量鸡种mtDNA 部分序列，为遗传多样性、亲缘关系研究积累了丰富资料。

本研究针对广东3个地方鸡种mtDNA D-loop全序列进行PCR 和测序，分析其遗传多样性，结合NCBI收录的地方鸡种、红色原鸡及绿头鸭D-loop全序列信息，分析其亲缘关系，为广东地方鸡种的保护和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 在各保种场核心群收集清远麻鸡（29只）、阳山鸡（29 只）、惠阳胡须鸡（40 只）共98 只母鸡血样。翅静脉采血1.2 mL/只，加入EDTA 抗凝管后轻轻混匀并置于-20℃保存。从NCBI 下载我国地方鸡及红色原鸡mtDNA D-loop 序列，并以绿头鸭作为计算遗传距离的参考外群（表1）。

表1 NCBI 中下载的mtDNA D-loop 序列

1.2 引物设计及DNA 提取 根据GenBank 中红色原鸡mtDNA 序列（GenBank 登录号：NC_007235）设计引物，上游引物：5'-AAACACCCAAACTCACTAAC-3'；下游引物：5'-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3'，产物约1 585/1 586 bp。按照全血基因组DNA 制备试剂盒（Magen 公司）提取DNA。

1.3 PCR 反应及测序 PCR 反应体系为50 μL：2×Taq PCR Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，Taq 酶0.5 μL，DNA 模板2 μL，ddHO 20.5 μL。反应程序为95℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35个循环；72℃后延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR 产物进行电泳检测，合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化测序。

1.4 数据分析 DNA 序列用DNAStar 5.0 拼接并人工校对，用Clustal X 1.8 进行多重比对剪辑，仅留取D-loop全长序列进行后续分析。用DnaSP 5.0 软件统计单倍型数、多态位点数、单倍型多样度（H）、核苷酸多样度（P）和核苷酸平均差异数（K），并提取单倍型。以绿头鸭为外群，利用MEGA 6.0 软件的 Kimura 2-parameter（K2P）模型计算遗传距离；并应用邻接法（NJ）构建系统发生树（采用Kimura 双参数模型，Bootstrap 抽样重复1 000 次）。

2 结果

2.1 mtDNA D-loop 区全长序列 利用PCR 扩增获得广东3个地方鸡种mtDNA D-loop全序列，产物大小约1 600 bp（图1）。PCR 产物测序后经BLAST 比对，确认获得了D-loop 序列，测序得到98个样本的序列用于后续分析。

图1 广东3个地方鸡种DNA D-loop全序列PCR 扩增结果

2.2 mtDNA D-loop 区碱基组成 本研究获得了1 586/1 585 bp 目的序列，包括部分tRNA Pro、D-loop 和部分tRNA Phe序列，留取1 231/1 232 bp mtDNA D-loop全序列用于后续分析。3个地方鸡种A、T、C 和G 碱基含量分别为26.5%～26.7%、33.5%～33.6%、26.4%～26.6%和13.3%～13.4%，各鸡种对应碱基含量差异不大，平均G+C 含量为39.8%，明显低于A+T 含量20.2%（表2）。

表2 mtDNA D-loop 序列碱基含量

2.3 mtDNA D-loop 序列多样性 98个个体mtDNA D-loop 序列检测到44个变异位点，其中单一多态位点6个、简约信息位点38个，转换率（81.82%）远大于颠换率（22.22%）。98个个体具有34个单倍型（Hap 1～Hap 34），单倍型平均多样度（H）为0.923±0.018，清远麻鸡单倍型数最多，惠阳胡须鸡最少；核苷酸平均多样度（P）为0.007 43，核苷酸平均差异数（K）为9.142。由表3 可知，各群体H为0.659～0.953，清远麻鸡>阳山鸡>惠阳胡须鸡；P为0.001 28～0.008 30，K 为1.578～10.219，阳山鸡>清远麻鸡>惠阳胡须鸡。

表3 mtDNA D-loop 基因序列碱基多态

2.4 mtDNA D-loop 的遗传结构 3个地方鸡种mtDNA D-loop 区的44个变异位点中定义了34 种单倍型（Hap 1～Hap 34）（表4），清远麻鸡有17个单倍型，各单倍型含有1～4个个体，其中Hap 1 和Hap 6 均含有4个个体；阳山鸡有11个单倍型，各单倍型含有1～5个个体，其中Hap 7 和Hap 8 均含有5个个体；惠阳胡须鸡有10个单倍型，其中Hap 26 含有23个个体，为优势单倍型，占该群体的57.5%。

表4 mtDNA D-loop 区的单倍型及其序列突变位点

根据Liu 等对家鸡世系的划分方法，广东3个地方鸡群体有6个世系类型（A、B、C、D、E 和H），C 世系为优势世系，包含的样本数最多，占比46.94%（46/98），包括惠阳胡须鸡（40个）、阳山鸡（5个）和清远麻鸡（1个）；其次为B 世系，占24.49%（24/98），包括清远麻鸡（18个）和阳山鸡（6个）。A 世系包含13个样本，包括阳山鸡（11个）和清远麻鸡（2个）；D、E 和H 世系包括样本数均较少（3～7个）。阳山鸡、清远麻鸡和惠阳胡须鸡的优势世系分别为A、B 和C 世系（表5）。

表5 3个地方鸡种群体的世系归类

2.5 不同鸡种之间的进化分歧 29个鸡种分歧值分布在0.002～0.016 之间，其中63.68% 的鸡种分歧值在0.002～0.01 之间，36.32%的鸡种分歧值为在0.011～0.016之间，29个鸡种与外群绿头鸭的分歧值均大于0.660（表6）。与阳山鸡、清远麻鸡、惠阳胡须鸡遗传距离较近（分歧值均为小于0.01）的鸡种分别有21个、20个和12个；阳山鸡与安义瓦灰鸡、崇仁麻鸡、丝羽乌骨鸡分歧值最小（0.007）；清远麻鸡与安义瓦灰鸡、崇仁麻鸡、岑溪三黄鸡的分歧值最小（0.004）；惠阳胡须鸡与雪峰乌骨鸡、绿耳乌鸡和广西麻鸡的分歧值最小（0.002），广东3个地方鸡种与尼西鸡、腾冲雪鸡和藏鸡的分歧值较大（0.011～0.013）。

表6 29个鸡种及绿头鸭的进化分歧估计值

分析98 条检测序列与NCBI 下载的33 条D-loop序列，共同获得51个单倍型（Hap 1～Hap 51）。Hap 24 为惠阳胡须鸡的主要单倍型（占比57.5%）；清远麻鸡与阳山鸡具有多个单倍型，各自主要单倍型分别为Hap 1、Hap 13、Hap 6 和Hap 4、Hap 7、Hap 8。网络下载资源中有18个资源分别独立形成单倍型（表7）。

表7 29个鸡种及绿头鸭单倍型及分布

利用Mega5.10 软件，基于单倍型构建系统发生树。由图2 可知，Hap 42（绿头鸭）独为一类，29个地方鸡种和红原鸡聚为一大类，符合外群独立分支规律；红原鸡（Hap 39、Hap 40、Hap 51）、斗鸡（吐鲁番鸡、大围山微型鸡）（Hap 34）、尼西鸡（Hap 44）、仙居鸡（Hap 50）等原鸡或杂交选育程度不足的鸡种聚为一个分支（A）；其他鸡种可以归为一个分支，该分支形成了3个小的分支（B、C 和D），包括了广东3个地方鸡种和19个其他地方鸡种。与群体H结果一致，97.5%（39/40）的惠阳胡须鸡聚集在C 分支；与鸡种间进化分歧结果一致，惠阳胡须鸡与雪峰乌骨鸡（Hap 49）、绿耳乌鸡（Hap 3）和广西麻鸡（Hap 3）聚在一起。阳山鸡和清远麻鸡在B、C 和D 分支中均有一个数量的分布，其中B 分支包括了较多的阳山鸡（17/29）和清远麻鸡（20/29）个体。

图2 基于29个鸡种及绿头鸭mtDNA D-loop全序列构建的NJ 系统发生树

3 讨 论

本研究获得了广东3个地方鸡种共98个个体mtDNA D-loop全长序列，碱基组成相似，A、T、C和G 碱基平均含量分别为26.6%、33.6%、26.5% 和13.3%，平均A+T 含量为60.2%，明显高于G+C 含量39.8%，表明该区域内碱基组成具有偏倚性，这与家鸡mtDNA D-loop 区为非编码区、富集A/T 碱基的结论一致。mtDNA D-loop全长序列共检测到1个插入/缺失和44个单核苷酸多态位点，其中转换率为81.82%、颠换率为22.22%，符合脊椎动物碱基组成特征，这与

mtDNA 在进化中转换发生率高于颠换的规律一致，与前人研究结果相似。

遗传多样性是物种进化和适应环境的基础，也是遗传资源选择和选育的关键。mtDNAH和P是衡量群体多态和变异程度的重要指标，数值越高，群体多态性越高。遗传多样性高的群体可有效应对环境变化，具备进化潜力和适应能力。本研究检测的98个个体定义了34个单倍型，样本中H由高到低依次为清远麻鸡（0.953±0.020）、阳山鸡（0.909±0.024）、惠阳胡须鸡（0.659±0.081）；P平均为0.007 43，由高到低依次为阳山鸡（0.008 30±0.000 59）、清远麻鸡（0.005 94±0.000 60）、惠阳胡须鸡（0.001 28±0.000 74）。3个鸡种中清远麻鸡具有最高的H和较高的P，高于多数已报道的国内地方鸡种，如黑狼山鸡H=0.464、P=0.004 31，茶花鸡H=0.476、P=0.003 01，贵妃鸡H=0.538、P=0.005 90，鹿苑鸡H=0.549、P=0.002 37，略阳鸡H=0.549、P=0.002 37，儋州鸡H=0.571、P=0.005 37，白狼山鸡H=0.618、P=0.004 60，溧阳H=0.632、P=0.004 15，大围山微型鸡H=0.685、P=0.004 43，香炉山鸡H=0.814、P=0.004 47和寿光鸡H=0.864、P=0.005 30等；低于阿贝藏鸡3个系（H为0.989～0.997，P为0.106～0.108）。阳山鸡H和P处于较为丰富的状态，而惠阳胡须鸡遗传多样性相对较低，略高于狼山鸡、茶花鸡、贵妃鸡、鹿苑鸡、略阳鸡、儋州鸡和溧阳鸡等。屠云洁等基于线粒体基因研究发现清远麻鸡H=0.583 3、P=0.003 69；黄勋和等也基于该基因发现清远麻鸡H=0.819、P=0.003 92，阳山鸡H=0.842、P=0.004 31，惠阳胡须鸡H=0.825、P=0.004 31。邢文丽等利用14个微卫星标记分析清远麻鸡平均杂合度为0.501，本研究中清远麻鸡和阳山鸡多样性高于前人研究结果，而惠阳胡须鸡多样性低于前人研究结果。针对同一品种出现研究结果不一致的情况，主要影响因素包括检测方法、样本来源及检测个体数量等。

此外，以往有关鸡线粒体多态性的研究主要集中在D-loop 高变区，本团队前期以D-loop 高变区研究了2个清远麻鸡群体（H为0.882～0.767，P为0.008 49～0.011 67）、阳山鸡群体（H=0.753，P=0.009 29）的遗传多样性，本研究进一步证实线粒体D-loop 高变区研究信息不能完全覆盖D-loop 区全部突变位点，建议采用D-loop全序列进行鸡品种遗传多样性分析和系统进化研究，以整合更全面的信息、得到更准确的结果。

近年大量研究进一步证实了家鸡的多母系起源，Liu 等根据所检测的834 份家鸡和66 份红色原鸡的mtDNA 控制区序列构建系统发生树，将世界范围的家鸡和红色原鸡划分为A～I 共11个世系，其中A 和B 世系主要分布在东亚和东南亚地区，C 世系为东亚特有世系，E 主要在中东、欧洲和印度，F、G 和H 世系为云南及邻近地区（广西、越南等）特有世系。本研究中清远麻鸡可分为A、B、C、D 和E 5个母系世系，其中B世系占优势（62.07%），E 为其特有世系（24.14%）；阳山鸡具有A、B、C、D 和H 5个母系世系，其中A世系占优势（37.93%），H 为其特有世系（17.24%）；惠阳胡须鸡仅有1个母系世系（C）。相对应的，综合29个鸡种mtDNA D-loop全序列构建的NJ 系统发生树，清远麻鸡相对应的单倍型分布A、B、C 和D 分支，且B 分支为优势分支，占比达68.96%；阳山鸡对应的单倍型分布在B、C 和D 分支；惠阳胡须鸡全部分布于C分支；与单独利用上述3个广东地方鸡种进行母系来源分析结果相一致。上述研究结果表明本研究检测的清远麻鸡和阳山鸡可能有4个母系来源，而惠阳胡须鸡仅有1个母系来源。

由此可知，清远麻鸡和阳山鸡表现出较高的遗传多样性，开发前景广阔；惠阳胡须鸡是广东地方品种中开发利用程度较高的品种，本研究检测群体多样性相对较低可能与其固有或与经过一定的保种世代有关，针对该群体建议定期从原产地引进原种或开展不同保种群的交流，以保持较高的遗传多样性。

4 结 论

本研究检测的广东3个地方鸡种mtDNA D-loop 区全长1 231～1 232 bp，清远麻鸡和阳山鸡具有丰富的多样性，惠阳胡须鸡多样性中等，所有个体可归类到A、B、C、D、E 和H 共6个世系，在进化过程中清远麻鸡和阳山鸡存在4个母系来源，惠阳胡须鸡仅1个母系来源，本研究结果为后续地方鸡种的保护与开发利用提供了参考。