C 型产气荚膜梭菌抗原含量与免疫攻毒保护的关系

蔡卫忠，吴早林，全 涛，刘泽文，田永祥

（1.红安县农业农村局，湖北 红安 438499；2.鹤峰县农业农村局，湖北 鹤峰 445800；3.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室/畜禽病原微生物学湖北省重点实验室，武汉 430064）

为了验证C 型产气荚膜梭菌毒素抗原的保护效果，确定仔猪大肠杆菌病（K88+K99+987P）、产气荚膜梭菌病（C 型）二联灭活疫苗配制中的抗原含量，开展了试验研究。

1 材料

1.1 菌种

制苗及检验用C 型产气荚膜梭菌C59-2 菌株，F10 代基础种子，由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所制备、检验和保存。

1.2 梭菌液体培养基配制

按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》［1］中的方法进行制备。

1.3 冻干保护剂配制

准确称取明胶20 g、蔗糖100 g，充分溶解于950 mL 纯化水中，用2 mol/L NaOH 调pH 至7.2～7.6，加纯化水定容至1 000 mL，116 ℃高压灭菌30 min，冷却后备用。

1.4 疫苗稀释液

氢氧化铝胶生理盐水稀释液，由武汉中博生物股份有限公司制备、检验和保存。

1.5 试验动物

16～20 g 昆明小鼠，购自武汉生物制品研究所；怀孕69～74 d 母猪（C 型产气荚膜梭菌毒素中和抗体阴性）8 头，购于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所试验猪场。

2 方法

2.1 抗原的制备

按照文献［2］进行C 型产气荚膜梭菌C59-2 菌株的培养，取样测定毒素的含量，将毒素用甲醛灭活脱毒，经超滤系统进行浓缩。

2.2 疫苗的配制

根据浓缩毒素的含量，用无菌生理盐水分别稀释至2 000、3 000、4 000 MLD/mL 3 个浓度，然后加入与抗原等体积的冻干保护剂，充分搅拌混匀，定量分装每瓶2 mL，经冷冻真空干燥制成疫苗，加盖密封贴签，制备3 种不同毒素抗原含量单苗，每头份疫苗的毒素含量分别为2 000、3 000、4 000 MLD（以脱毒前计）。

2.3 试验母猪分组

将8 头怀孕69～74 d 母猪（产前40～45 d）随机分为4 组，分别为3 个免疫组（每组2 头）和1 个对照组（2 头）。分组后将猪依次编号，分栏饲养。

2.4 免疫

将3 种疫苗随机取样，用稀释液稀释成每头份2 mL，平衡至室温后使用，采用肌肉注射接种途径，每种疫苗接种2 头怀孕母猪，于产前40～45 d 一免，每头猪注射疫苗2 mL，25 d后按同样剂量进行二免。

2.5 哺乳仔猪攻毒试验

母猪产仔后，在各免疫组母猪所产仔猪中随机选取5 头，用C 型产气荚膜梭菌C59-2 毒素攻毒。在未免疫组母猪所产仔猪中随机选取10 头分为2组，分别为攻毒对照组和正常对照组，每组5 头（表1）。哺乳仔猪于出生并采食初乳24 h 内攻毒，对免疫组及攻毒对照组，静脉注射最小致死剂量的C 型产气荚膜梭菌毒素。攻毒后连续观察5 d，根据仔猪攻毒后的临床表现统计各试验组的发病情况。

表1 疫苗抗原含量与攻毒保护平行关系试验分组情况

3 结果

3.1 母猪分娩情况

8 头母猪均成功分娩，无流产现象。统计产仔情况，产仔总数为84 头，仔猪均健活，无弱仔和死胎，免疫组和对照组产仔情况无明显差异（表2）。

表2 母猪产仔情况

3.2 哺乳仔猪攻毒试验结果

用最小致死剂量的C 型产气荚膜梭菌毒素对免疫和对照组母猪所产并采食初乳24 h 内仔猪攻毒。攻毒对照组在攻毒后24 h 内全部死亡，毒素含量为2 000、3 000、4 000 MLD/mL 疫苗免疫组所产仔猪对梭菌毒素攻毒后的保护率分别为60%、80%、100%（表3）。

表3 梭菌疫苗免疫组仔猪攻毒试验结果

4 结论与讨论

C 型产气荚膜梭菌主要引起新生仔猪红痢，主要发生于3 日龄以内的新生仔猪［3］，发病仔猪以腹泻为主要临床症状，而且发病急剧，病程短促，发病率和死亡率均较高，注射疫苗是预防该病发生的有效手段［4］。C 型产气荚膜梭菌外毒素均具有很好的免疫原性，能够刺激机体产生抗体，抵抗C 型产气荚膜梭菌的攻击［5］。

试验结果表明，用C 型产气荚膜梭菌毒素制成的疫苗对怀孕母猪安全，免疫母猪均正常产仔，产仔数与对照组母猪无明显区别，且无死胎和弱仔。C型产气荚膜梭菌灭活疫苗不同毒素抗原含量与攻毒保护率具有良好的平行关系，毒素抗原含量不低于3 000 MLD/mL 时，免疫组攻毒保护率不低于80%。确定了使仔猪获得保护的最低产气荚膜梭菌毒素抗原含量为3 000 MLD/mL。为了确保疫苗的质量，将每头份仔猪大肠杆菌病（K88+K99+987P）、产气荚膜梭菌病（C 型）二联灭活疫苗产气荚膜梭菌毒素抗原最低值确定为4 000 MLD/mL。