高效液相色谱-串联质谱法检测奶牛粪污及降解产物中雌激素

邵志勇，周 源，何 斌，吴利军，杨文海，陈夏冰，刘 武，金尔光

（武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430208）

随着人民生活水平逐渐提高，人们对肉、蛋、奶的需求量日益增加，刺激畜牧业朝着集约化方向快速扩展［1］，同时带来大量的畜禽粪污，造成的环境污染问题日益凸显。对畜禽粪污的污染仍主要集中在N、P、重金属和农药等常规污染物的研究和控制，雌激素等污染物未得到足够的重视［2］。环境中的雌激素属于典型的内分泌干扰物，具有较强的生态和生理毒性，可以打破生物体自身的平稳状态，使各个平稳运行的系统失去稳定状态［3］，从而导致男性不育、女性生殖器官肿瘤、儿童早熟，野生动物繁殖能力下降及水生生物雌性化等生殖疾病［4］。据统计，美国禽畜养殖场排泄产生的雌激素量约为污水处理厂排放的10 倍［5］，其中，奶牛粪污中的雌激素占畜禽粪污中雌激素的90%［6］。

用于动物性食品、液体样品中雌激素的检测方法较多，有气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱串联质谱法（GC-MS）、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）、电感耦合等离子发射光谱法（ICP）、电感耦合等离子体串联质谱法（ICP-MS）［7，8］，但关于奶牛粪污中雌激素的检测方法鲜有报道。为保障人类和动物的生殖代谢等健康问题，建立一种奶牛粪污及其降解产物中雌激素含量检测方法至关重要。本研究使用高效液相色谱-串联质谱法对奶牛粪污及其降解产物样品中雌酮、17-α-雌二醇、17-β-雌二醇、雌三醇4 种天然雌激素的检测方法进行研究，对奶牛粪污的安全处理与资源化利用的安全评价有积极意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

MS205DU 电子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；SB-5200D 超声波清洗仪，宁波新芝生物科技有限公司；RE-52AA 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；QYCQ-24B+DP-01 固相萃取装置，上海乔跃电子有限公司；ZX-DC 氮吹仪北京众信佳仪科技有限公司；Acquity UPLC Xevo TQ-S 高效液相色谱-质谱联用仪（配电子喷雾离子源），美国Waters 公司；Milli-Q 纯水仪，美国Millipore 公司；3K15 高速冷冻离心机，美国Sigma 公司；Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），美国Waters 公司。

雌酮（纯度1 000 μg/mL，CAS 号53-16-7），17-α-雌二醇（纯度1 000 μg/mL，CAS 号57-91-0），雌三醇（纯度1 000 μg/mL，CAS 号50-27-1），购于美国o2si smart solutions 公司；17-β-雌二醇（纯度100 μg/mL，CAS 号50-28-2），购于法国A2S Analytical Stan⁃dard Solutions 公司；17-雌三醇-D2（纯度≥98%，79037-36-8），购于上海甄准生物科技有限公司；17-β -雌 二 醇-D2（纯 度1 000 μg/mL，CAS 号53866-33-4），北京曼哈格生物科技有限公司；雌酮-D2（纯度100 μg/mL，CAS 号56588-58-0），坛墨质检科技股份有限公司；乙腈、甲醇购于美国Ther⁃mo Fisher 公司。氯化钠、氨水、盐酸、冰乙酸等试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 移取3 种内标对照品200 μL 至10.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配置成浓度为2 μg/mL 的内标溶液。

雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的混合对照品溶液储备液的配制，移取3 种激素的混合对照品溶液200 μL 于10.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，并逐级稀释，浓度依次为0、2、5、20、50、100 和200 ng/mL。所有浓度的激素混合标准溶液中均加入50 μL 的内标溶液。

17-α-雌二醇的混合对照品溶液储备液的配制，移取17-α-雌二醇的混合对照品溶液200 μL 于10.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，并逐级稀释，浓度依次为0、20、50、100、200、500 和1 000 ng/mL。以上所有浓度的激素混合标准溶液中均加入50 μL 的内标溶液。

1.2.2 样品前处理 分别采集哺乳牛、犊牛粪样各3 份，发酵床上层和下层样品各1 份，约500 g 做为代表性样品，黑色塑料袋密封，并立即存放于冰盒中冷藏存放，然后保持冷冻状态尽快运回实验室，并冷冻干燥处理。冻干后的样品避光保存，分析前用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于2 mm ，混合均匀后缩分至100 g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。

称取2.00 g 样品，加入50 μL 氘代内标，再加入20 mL 乙腈，振荡1 h，离心，取上清液10 mL，氮吹近干，加入30%甲醇水溶液5 mL，待净化。

1.2.3 样品净化 预先用以5 mL 乙酸乙酯、5 mL 甲醇、5 mL pH 2.0 盐酸溶液活化HLB 小柱，取备用液上柱，以5 mL 30%甲醇水溶液洗涤，抽至近干后加入3 mL 的石油醚洗涤，将小柱抽干，再用5 mL 乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于玻璃离心管中，氮吹至近干，用2 mL 50%甲醇水溶液溶解，过膜，上机检测。

1.2.4 检测条件 液相色谱条件，C18 柱，柱长100 mm，内径2.1 mm，粒径1.8 μm；流速为0.4 mL/min；进样量为10 μL；柱温为35 ℃。梯度洗脱程序见表1。

质谱条件，电喷雾离子源，负离子模式；脱溶剂气温度500 ℃；脱溶剂气、锥孔气均为高纯氮气；离子源温度150 ℃；脱溶剂气流速1 000 L/h；锥孔气流速150 L/h；碰撞气流速0.13 mL/min；多反应监测（MRM）模式，监测条件见表2。4 种激素在MRM 条件下色谱见图1。

图1 奶牛粪污中4 种激素色谱

表2 多反应监测条件

2 结果与分析

2.1 标准曲线和定量限

由于奶牛粪污及降解产物中的激素是一种内源性物质，很难获得不含激素的空白试样用于检出限的评定。通过添加含有氘代的标准溶液，按照梯度稀释，高效液相色谱-串联质谱分析，4 种激素均呈现了良好的线性关系（R2>0.99）（表3）。

由表3 可知，雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的曲线以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，在2~200 ng/mL内线性关系良好，17-α-雌二醇的曲线以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，在20~1 000 ng/mL 内线性关系良好（R2≥0.995）。

表3 标准曲线方程和相关系数

采用空白基质提取液逐级稀释标准溶液的方法确定定量限，雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的定量限为2 ng/mL；17-α-雌二醇的定量限为20 ng/mL。

2.2 回收率

称取牛粪3 份，每份2.00 g 样品（偏差最大0.02 g），3 份样品中分别加入100、50 和0 μL 激素混合标准品，每份样品加入50 μL 氘代内标，充分混匀后静置2 h，4 种激素的平均回收率为93.6%～145.3%，表明该方法具有良好的检测性能（表4）。

表4 回收率

2.3 奶牛粪污及降解产物中雌激素的测定结果

将奶牛粪污及微生物异位发酵床中的样品经预处理和色谱条件提取并检测。结果发现，在犊牛粪中未检出雌酮，而哺乳牛粪中检出雌酮；犊牛雌三醇的检出量高于哺乳牛；犊牛的雌激素总检出量低于哺乳牛，与王真［9］研究结果不一致，与李艳等［10］研究结果一致；梁紫薇等［11］研究发现，在相同品种、相同饲喂方式下，不同季节肉鸡雌激素的排放量也存在较大差异。

样品中雌激素检查结果见表5。由表5 可知，发酵后的牛粪雌激素总检出量低于犊牛、哺乳牛，发酵床上层样品中只有17-β-雌二醇未检出，其他3 种雌激素检出，发酵床下层样品均未检出，可能受发酵床中微生物影响，与郭立泉等［12］研究结果一致，说明生物发酵床对相关雌激素具有一定降解功能。

表5 奶牛粪污及降解产物中激素检测结果

3 结论

LC-MS/MS 技术拥有高灵敏度、高分辨率、高特异性和高效分离等特点［13］，被用于实现解析化合物分子结构或样品的定性定量分析。利用其特性与实际情况相结合，建立了一种用高效液相色谱-串联质谱法检测奶牛粪污及降解产物中4 种天然激素的检测方法，该方法对样品中雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的检出限为2 ng/mL，17-α-雌二醇的检出限为20 ng/mL，加50 μL 氘代内标时，回收率为93.6%～145.3%。运用该方法对奶牛场粪污及微生物异位发酵床垫料中的激素残留进行检测，部分未检出。该方法可用于奶牛粪污及降解产物中激素残留的检测，方法灵敏度高、检出限低，为奶牛粪污及降解产物中激素的测定提供了一种高效、简便的检测方法。