玉溪市一例散养土杂鸡球虫病的虫种鉴定

葛丽红，赵 津，王永兴，赵国洪，杨锁柱，王正虹，王洪伟

（1.玉溪农业职业技术学院，云南省玉溪市畜禽疫病检测重点实验室，云南 玉溪 653106；2.玉溪云兴兽药经营部，云南 玉溪 653100）

玉溪市一林下放养土杂鸡场饲养土杂鸡1 500 只，2021 年6 月陆续有25 日龄左右的鸡出现精神沉郁，羽毛蓬松，食欲不振，腹泻，血便，部分鸡只死亡等现象。通过对病鸡进行病理剖检、虫卵检查、虫卵计数、特异性引物PCR 扩增及虫种18S rRNA 基因序列分析，确定病鸡寄生虫的感染情况和感染程度，为本病的有效防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 采样 对发生血便症状的病鸡进行病理剖检，采集盲肠内容物和血便，冷冻保存，用于后续检测。

1.2 主要试剂及虫株 蛋白酶K、SDS、Tris 饱和酚等试剂购自生工生物工程（上海）有限公司，Marker购自广州东胜生物科技有限公司，PCRmix购自北京艾德莱生物科技有限公司；含有柔嫩艾美耳球虫PTMZ株的鸡球虫病四价活疫苗购自正典生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯产品。

1.3 虫卵检查 参照国标《动物球虫病诊断技术》［8］进行。

1.3.1 定性检查 采集鸡群的新鲜混合粪便样品500 g，取10 g 放入烧杯，加50 mL 蒸馏水混匀，用60 目筛子过滤3 次。滤液以2 500 r/min 离心10 min，弃上清，沉淀用饱和食盐水冲洗3 次，静置5 min，取上层液在40×10倍显微镜下观察。

部分新鲜粪便放置于28 ℃恒温恒湿培养箱中培养48 h，采用饱和食盐水漂浮法处理后，在100×10倍显微镜下观察。

1.3.2 定量检查 称取2 g 粪便样品用蒸馏水混匀，用60目筛子过滤3次，滤液以2 500 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用饱和食盐水冲洗3 次，补加饱和食盐水至60 mL，摇匀，静置5 min。用移液枪吸取上层液注满麦氏计数板，静置5 min，于40×10倍镜下测量虫卵大小，同时进行虫卵计数。

1.4 样品DNA 的提取 取粪便样品0.2 g，用1 mL 双蒸水混匀制成卵囊液。取卵囊液500 μL于－20℃超低温冰箱中反复冻融3次，每次20min；最后一次解冻后加入400 μL Tris 饱和酚、60 μL SDS、25 μL 蛋白酶K，振摇，置37 ℃培养箱过夜；加500μL Tris饱和酚，振摇，1200r/min离心5min；取上清液加200 μL Tris饱和酚和200 μL 氯仿，振摇，1 200 r/min 离心5 min；取上清液加400 μL氯仿振摇，1 200 r/min离心5 min；取上清液加800 μL 无水乙醇和40 μL NaAc（醋酸钠）混匀，－20 ℃下冷冻0.5 h取出，1 200 r/min离心10 min，弃上清，吹干；加400 μL 70%乙醇洗涤沉淀，1 200 r/min 离心10 min，弃上清，吹干；把沉淀溶解于40 μL双蒸水中备用。

1.5 样品DNA 特异性扩增 按行业标准［2-3］进行。将柔嫩艾美耳球虫分型检测引物送上海生工合成，引物序列见表1。反应条件：94 ℃预变性5 min；94℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，30 min后观察扩增结果。

表1 柔嫩艾美耳球虫PCR扩增基因引物

1.6 鸡球虫18S rRNA 基因序列分析 将样品DNA 送上海生工进行18S rRNA 基因序列测序。应用MegAlign 分析软件，对检测到的虫株18S rRNA 序列与GenBank 上公布的不同种球虫的18S rRNA 序列进行遗传进化分析［4-5］，相关虫种信息见表2。

表2 不同种球虫的18S rRNA序列信息

2 结果与分析

2.1 病理剖检结果 解剖发现病鸡盲肠粗大肿胀，剪开肠腔，内有棕黑色黏液样内容物流出，其他组织器官无肉眼可见病变（图1）。

图1 盲肠病变

2.2 虫卵检查结果

2.2.1 定性检查 粪便样品通过饱和食盐水漂浮法处理后，镜检（400×）发现大量卵圆形虫卵；粪便经28 ℃培养并经漂浮法处理后，镜检（1 000×）发现每个孢子化卵囊含4 个孢子囊，每个孢子囊含有2个子孢子。

2.2.2 定量检查 在显微镜（400×）视野下进行虫卵大小测量和计数，得出球虫卵长度在22.922～26.621 μm，宽度在17.433～19.631 μm（表3），大小和柔嫩艾美耳球虫接近；两个计数室三次重复的平均虫卵数为85 个（表4）。根据国标里的计算公式计算出每克粪便中的卵囊数（OPG），OPG＝A×200＝85×200＝1.7×104。

表3 球虫卵囊大小 μm

表4 计数室内平均虫卵数 个

2.3 鸡球虫基因组PCR检测 用柔嫩艾美耳球虫特异性引物对粪样DNA进行PCR扩增，结果样品与阳性对照均得到463 bp 的特异性目的条带（图2）。

图2 临床样品PCR检测结果

2.4 鸡球虫18S rRNA基因序列分析结果 对该球虫18S rRNA 序列进行BLAST 比对分析，用MEGA11 分析软件和邻接法（NJ 法）对该序列与GenBank 上公布的不同种球虫的18S rRNA 序列进行遗传进化分析，绘制进化树。结果显示：该球虫与GenBank 公布的7 株柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）的同源性最高，为99.61%～99.92%，且在进化树上构成一个分支；同时，毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫的亲缘关系最近，构成一个分支。

3 结论与分析

通过流行病学、病理症状、虫卵检查初步判断该病例为球虫感染，进一步通过柔嫩艾美耳球虫特异性引物PCR扩增、18S rRNA基因测序及遗传进化分析确定该球虫种为柔嫩艾美耳球虫，且与上海分离虫株（DQ136176）的同源性最高，达到99.92%。同时，毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫的亲缘关系最近，构成一个分支。这与蔡兰等［5］报道的结果相一致，二者生物学特性相似，都在盲肠发育成卵囊，而且是致病力最强的种。

通过虫卵计数计算出该病例每克粪便卵囊数（OPG）为1.7×104。根据国标判定标准［1］，判定该病例为中度感染。给养殖户建议采取“给药-停药-再给药”的方式全群投药［6］，用磺胺类药物加祛湿中药连用3 d，停3 d，再连用3 d。给药一个周期后，取粪便检测，视野内的卵囊数明显减少。证明该治疗方法具有显著疗效。

散养鸡由于活动范围广，粪便多散落在土壤中，而土壤是包括球虫在内的很多寄生虫的温床，散养鸡更容易接触到土壤，因此感染球虫等土源性寄生虫的概率大增［7］。预防建议：下批鸡群应重新划定圈养地，以防粪便残留引起循环感染；鸡群产生的粪便要统一收集进行发酵处理或太阳暴晒处理后再使用，以减少交叉感染［8］；在保证原场地表层土壤安全的情况下采取炼火土方式焚烧，杀死残留虫卵；采用疫苗预防，接种四价球虫苗的效果较好［9］。