种质库种质安全保存理论研究的进展与展望

尹广鹍，辛霞，张金梅，陈晓玲，刘运霞，何娟娟，黄雪琦，卢新雄

种质库种质安全保存理论研究的进展与展望

尹广鹍，辛霞，张金梅，陈晓玲，刘运霞，何娟娟，黄雪琦，卢新雄

中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081

安全保存是作物种质资源高水平保护的核心和可持续利用的前提。低温种质库是作物种质资源最主要的保存方式。延长种质保存寿命、维持种质遗传完整性和防止种质生活力意外丧失一直是种质安全保存的研究难点和热点。文中对近百年来种质库保存种质的研究历史进行了系统整理，指出：（1）种子低含水量和低贮藏温度是延长种子保存寿命的关键因素，由此形成的双低理论是种质库保存种质的理论基础；（2）库存种子生活力下降存在衰老拐点特性，拐点出现时是维持种质遗传完整性的低限，拐点理论是种质安全保存的理论基础；（3）已保存的种质在物理空间或保存方式上再备份保存一份，形成资源复份保存机制，复份保存机制是防止意外事故而导致资源无法挽回损失的保障措施。本文重点阐述了双低理论、拐点理论和资源复份保存机制的内涵、意义及其实践指导作用，以期进一步推动种质资源安全保存理论的发展。

种质库、安全保存、双低理论、拐点理论、复份保存机制

0 引言

前苏联作物育种学家瓦维洛夫和美国一些科学家的先驱性工作[1]，使人们认识到丰富的种质材料对于育种和科学研究的重要性，并从世界范围内收集了大量的种子类作物种质资源。当时的全苏作物栽培研究所（现称瓦维洛夫全俄植物科学研究所）和美国的4个区域作物引种站，均收集到成千上万份种质材料。但由于在室温条件下保存，种子生活力下降很快，导致当时收集到的资源损失严重。如在20世纪40年代，美国区域作物引种站发现其收集贮藏的16万余份种子样品，仅有5%—10%样品能在田间出苗，为此引种站利用空调降温技术建设低温库保存种子样品[2]。1958年美国在科罗拉多州的柯林斯堡建成了世界上第一座国家级低温种质库。20世纪70年代以后，俄罗斯、中国、印度、德国、日本、韩国、巴西等相继建立了国家级低温种质库，保存收集到的作物种质资源。据FAO统计，全球非原生境保护的740万份资源中，90%是以种子方式保存在1 300余座低温种质库中[3]。至2020年底，以种子形式收集保存资源最多的国家是美国、中国和印度，保存资源分别为56万、45.3万和43万份。

种质库保存种质资源是目前最主要的保存方式，可显著延长种子寿命，减少监测和更新次数，避免频繁更新而导致遗传完整性的丧失。但资源入种质库保存并不是一劳永逸，随着保存的作物种质资源种类和数量剧增，以及保存时间延长，保存种质的安全性问题日益突出。一是库存种质生活力下降，中国国家库种子生活力监测结果表明，保存10—12年，种子发芽率降至70%以下占比0.51%，而保存20—23年该比例增加到1.1%[4-5]。二是缺乏对库存种子生活力丧失特性的了解和有效的监测预警技术，不能及时发现生活力过低的种质材料。美国国家库检测了保存16—81年的4.2万份种子的生活力，发现其平均发芽率从初始的91%降低到58%。其中，保存34—36年的大豆和花生种子平均发芽率已从初始的90%以上降至21%以下[6]。甚至有报道指出，个别种质库多达50%的原始种质样品已丧失生活力或更新后发生了遗传漂变[7]。

因此，探究延长种质保存寿命、维持种质遗传完整性和防止种质生活力意外丧失一直是种质安全保存的研究热点和难点。经过近百年的发展，延长种质寿命的双低理论、安全保存拐点理论和资源复份保存机制，成为低温库种质资源安全保存的科学基础理论。本文中将重点阐述其理论内涵、意义及其实践指导作用，以期进一步推动种质资源安全保存理论和技术的发展。

1 延长种质寿命的双低理论

1.1 双低理论的内涵

著名种子生理学家HARRINGTON[8]首次提出延长种子寿命的双低理论：即种子含水量每降低1%（含水量适应范围4%—14%）或贮藏温度每降低5℃（贮藏温度适应范围0—50℃），种子寿命可延长1倍。其实古代保存良种时，会把种子贮藏在坛罐中，坛罐的底部和上部铺上石灰并存放于地窖中，其原理是利用相对低的种子含水量和贮藏温度以延长种子保存寿命。20世纪40年代，美国区域作物引种站开始建设低温冷库以保存种质材料，取得了良好的保存效果。随后美国等国家采用这一技术建设国家级低温种质库以保存大批量收集的种质资源[1]。在保存温度恒定的条件下，只有在适宜的含水量下，种子寿命才能得到最大程度的延长。ROBERTS[9]和Ellis等[10]依据种子贮藏习性将种子划分为正常性、顽拗性和中间性等不同类型，双低理论只适应于正常性种子，而大多数农作物种子的贮藏习性是正常性的，因此，低温种质库能够成为这类种质资源的保存主体。椰子、芒果等热带经济作物种子属于顽拗性种子，具有不耐干燥脱水和不耐低温的贮藏习性，不适于采用低温种质库方式进行保存。VERTUCCI等[11-12]提出“种子适宜含水量”保存，进一步完善了双低理论，主要包括每种作物或物种种子的适宜含水量是在温度20℃、相对湿度10%—15%的条件下达到的平衡含水量，换算重量百分比的含水量为3%—9%；在种子含水量恒定的条件下，种子寿命与贮藏温度在一定范围内呈负相关关系，即在含水量得到控制的情况下，降低贮藏温度是延长种子贮藏寿命的关键因素。但当温度低至一定程度时，若进一步降低种子贮藏温度，则其对种子寿命的影响程度逐渐降低。

FAO/IPGRI依据双低理论，提出了种质库长期贮藏标准：种子含水量3%—7%（依作物而定），贮藏温度为-18℃（可接受最低贮藏温度为＜0℃），同时也对每份种质保存粒数、监测、更新等指标，以及供电、防火等安全措施做出了规定[13]。该标准的制定有力地推动了种质库的建设，使种质库及其保存种质的数量显著增加。从20世纪70年代初期种质库数量不足10个、贮存的种质数量50万份，到1996年全世界1 300多座种质库、保存610万份种质资源（含重复），其中低温种质库达550万份。

该理论后来继续得到不断完善，即含水量不是越低越好。FAO在2014年制定的《种质库标准》[14]中，推荐种子保存含水量为在温度5—20℃、相对湿度10%—25%条件下达到的平衡含水量（含水量一般为3%—9%），而不再推荐以重量百分比表示的含水量。适宜含水量下限值就是干燥极限。因此，没有必要再进一步干燥脱水。干燥脱水过度，对种子贮藏反而有害[10, 15]。在此适宜含水量范围内，降低贮藏温度则是延长种子贮藏寿命的关键，但并不是越低越好，国际上推荐-18℃和3%—7%含水量作为种子长期贮藏的标准，这是一个折中的方案，主要原因是难有试验数据来证明种子在-30℃或更低温度下的贮藏寿命比-20℃条件下延长多少，且获得-20℃贮藏条件的制冷工艺较易实现且运行成本相对较低[10]。

1.2 双低理论的物理生化基础

种子含水量和贮藏温度是影响种子保存寿命的2个关键因素，当种子干燥脱水至相对低的适宜含水量时，细胞内游离水几乎被完全去除，细胞质呈一种无定型不平衡的高度黏滞态，即玻璃态[16]，此时分子运动几乎停止。对温度诱导的玻璃化，其发生点的温度称为玻璃化转变温度（glass transition temperature，g）[17]。低含水量和低温条件下，细胞内的自由水体积减小，生物组织容易形成很高黏度的玻璃态，抑制了细胞内有害化学反应的发生[18-19]。许多研究证实种子形成玻璃态是抑制种子劣变、延长种子寿命的生物物理学基础。例如，在高温高湿条件下，玉米、大豆种子细胞质玻璃态的消失，导致种子劣变速率急剧增加[20-21]。进一步模拟分析表明，种子在含水量为5%— 8%状态下长期贮藏时，玉米、大豆和豌豆种子所需求的长期贮藏临界温度均接近或低于玻璃化转变温度，即在长期库贮藏条件下（温度-18℃，含水量5%— 8%），种子的细胞质呈玻璃态[21]。

种子含水量和贮藏温度也影响着种子细胞的分子移动性。分子移动性是生物组织贮藏稳定性的关键因子，分子移动性越大，有害反应速率越大[22-23]。采用电子顺磁共振和动态力学分析，从力学角度研究贮藏温度和种子含水量与种子寿命的关系，发现种子寿命与细胞质内分子移动性负相关，即分子移动性最小时的含水量与种子寿命达到最大值时的含水量接近[24-26]。分子迁移率与种子老化速率密切相关[22-23]，分子迁移动力驱动了种子的劣变反应，从而导致了种子生活力丧失。利用动态力学分析研究不同含水量和贮藏温度条件下种子细胞的分子移动性与种子老化速率的关系，发现与g相似的α弛豫和种子的老化不相关（除非在高热或高湿条件下），但β弛豫与种子的老化相关，表明通过分析β弛豫，可用来研究探讨减缓种子老化的贮藏条件[26]。通过差示扫描量热法验证温度对分子移动性的影响，发现当种子含水量为7%时，g为28℃[27]，因此，对于低温库种质保存，当保存温度为-18—4℃时，种子的含水量没必要过低[27-28]。种子含水量每降低1%，g值则升高5—10℃。但一些种子含水量降低到一定值后，其生活力反而会降低[9, 29]。这可能是因为细胞玻璃态的水属于结合水，这些结合水是细胞内生物结构关键的组成部分[30-31]，移除这些结合水会损伤细胞组成物质的生物学结构，因而威胁到种子存活，降低了种子生活力[16]。另外，含水量过低时会加剧种子老化，其原因可能是细胞结合水的脱水伤害抵消了玻璃态所产生的保护作用。虽然干燥脱水作用会使g值上升而形成玻璃态，从而增强保护作用；但过度脱水会引起结合水的丧失而降低大分子的稳定性。对于一些淀粉类作物，过度脱水会造成种子干燥损伤，导致生活力下降、寿命缩短[32]。种子细胞质玻璃态中的水是一种可塑剂，可影响g、细胞质黏度和细胞内分子移动性[15]。根据优化后的Williams-Landel-Ferry方程，当保存温度＞g时，种子生活力与-g的关系可以用来代表种子含水量对种子存活环境稳定性的影响，含水量降低可引起g增加，从而延长种子寿命[21]。

低含水量和低温条件使酶代谢活动处于钝化状态。酶由蛋白质组成，具有复杂的分子结构。一方面，许多酶（尤其是变构酶）的分子结构会因含水量降低而钝化或失活；另一方面，种子含水量降低到一定程度时，底物和辅酶就难以运转到酶附近，同时辅助因子Mg2+、Ca2+、K+、Na+等也不能运转到相应的部位，即使有催化产物生成，也会因缺水而影响扩散，使后续反应无法进行。莴苣种子含水量＞5.7%时，种子处于非玻璃态，当含水量降低到2.9%—4.8%时则处于玻璃态，玻璃态种子的保存寿命比非玻璃态种子长。检测种子代谢产物发现，玻璃态种子中依赖酶的代谢活动处于钝化状态，其代谢以非酶促反应“阿马道里-美拉德反应”为主，终产物主要是醇类、醛类、烷类和酮类等脂质过氧化产物；而非玻璃态种子因细胞质处于液态，生化反应强烈，以糖酵解为主，其终产物主要是甲醇和乙醇等。相对于非玻璃态，玻璃态为维持种子生活力创造了最佳生存环境，既形成了一个防御系统以防止或减缓氧化损伤，又避免了贮藏蛋白、淀粉、糖类等物质的降解，确保种子在吸胀萌发时具备能利用的贮藏蛋白，以维持供应能量代谢系统的稳定，从而使其寿命得到延长。

FAO/IPGRI提出了种质贮藏的技术标准，长期贮藏温度为-18℃，种子含水量为5%—7%，其中大豆为8%[11]。在此保存条件下，种子达到玻璃化状态，分子流动性最小，大多数酶处于钝化状态，生化反应进行缓慢，因此，可有效延长种子保存寿命。

2 安全保存拐点理论

在低含水量和低温保存的条件下，种子生活力仍会丧失，最终导致发芽能力下降。例如，保存36年的3 635份大豆种子，平均发芽率从初始的92%降低到21%，保存34年的780份花生种子，平均发芽率从初始的89%降低到6%，且有部分种质资源的种子发芽率已经降至零[6]。中国国家库种子生活力监测结果也表明，1.4万余份种子贮藏20年后，发芽率降至70%以下的种子占到被监测种子的1.1%[5]。此外，种子生活力下降导致种质资源的遗传完整性丧失，甚至有报道指出个别种质库经更新后，多达50%的原始种质样品丧失了发芽能力或发生了遗传漂变[7, 33]。因此，如何确保库存种质的安全，即如何避免库存种质出现发芽率降至过低或导致种质遗传完整性丧失，是种质库管理者面临首要课题。卢新雄等[34-35]经过30多年研究和实践，创立了种质安全保存拐点理论，实现了保存理论的重要突破，为安全保存技术体系的构建提供了重要理论支撑。

2.1 拐点理论的内涵

要确保库存种子的安全保存，首先要了解库存种子在保存过程中的生活力丧失（存活）规律。卢新雄等[36]首次报道在低温库的贮藏条件下，小麦种子生活力曲线表现为反“S”型，即在贮藏的前11年，种子处于高生活力平台期，生活力几乎没有明显下降，贮藏11年的种子发芽率仍高达90.4%，而在随后3年间（贮藏年限12—15年），种子发芽率从83%快速下降至20.1%，贮藏年限16—20年发芽率下降又相对缓慢，因此，贮藏12—15年为生活力骤降期阶段。种子生活力由平台期转向骤降期的过渡区，称为种子衰老拐点。同一作物种子在不同保存条件下，其生活力丧失的拐点基本相近，发芽率范围为70%—85%[34-40]。换言之，种子贮藏过程中的存活曲线呈反“S”型且存在衰老拐点的特性是作物种子的共有特性，其不受保存条件、种子含水量、初始发芽率等影响。当水稻、小麦、玉米、大豆、蚕豆等作物种质发芽率低于衰老拐点后更新，群体遗传完整性丧失[41-44]，尤其是异质群体的地方品种表现更明显。明确了当各作物的种子生活力下降至衰老拐点时，就应当进行更新，以维持种质的遗传完整性。这一发现为各作物确定种质更新临界值提供了依据，也明确了种质安全保存年限是生活力从起始降至拐点的年限（高生活力平台期）。由此，提出了维持生活力高于拐点以保障遗传完整性的安全保存拐点理论（图1）。其内涵为：在种质资源保存环节，一方面尽可能延缓衰老拐点出现，即延长种质保存寿命，另一方面更为关键的是需要预警出生活力降至拐点的种质；在种质繁殖更新环节中，需安全更新临近拐点的种质；在种质入库的初始环节，其起始生活力需高于拐点。

图1 作物种质资源安全保存的拐点理论

Fig. 1 The critical node theory of the safe conservation of crop germplasm resources

2.2 拐点理论的生理生化基础

基于种质衰老拐点的活性氧积累、氧化还原态紊乱、蛋白羰基化修饰等研究，探明种质衰老拐点出现的生理生化基础是氧化损伤加剧导致脂质、线粒体能量等代谢功能剧降。种子生活力降至衰老拐点，种子的蛋白、核酸、膜脂等大分子物质发生了严重的氧化损伤。在衰老拐点，超氧阴离子自由基（O2-·）和过氧化氢（H2O2）含量增加，活性氧积累，抗氧化系统活性下降，脂质过氧化损伤，引起膜系统完整性降低，同时生成活性羰基小分子或者挥发性物质。活性羰基小分子攻击蛋白质，发生羰基化修饰，是导致蛋白功能下降的主要因素。在衰老拐点，种子蛋白的羰基化水平显著提高，糖酵解、戊糖磷酸途径和TCA循环等代谢相关蛋白和APX等抗氧化酶，参与能量代谢和逆境胁迫响应等相关蛋白呈下调表达，且被羰基化修饰；贮藏蛋白呈上调表达，且也发生羰基化修饰[40, 45-49]。种子生活力降至拐点时，线粒体相关的基因和蛋白的表达水平发生了较大的改变：（1）线粒体在吸胀后较难修复其结构，线粒体数量明显减少，膜结构不完整，生理活性显著降低；（2）线粒体电子传递途径功能活性下降，抑制了线粒体细胞色素途径，诱导了以及交替NADH脱氢酶、解偶联蛋白和交替氧化酶组成的交替途径的表达，弥补ATP的供应；（3）抑制了线粒体中参与碳代谢、氮代谢、能量代谢和抗氧化系统蛋白的表达，严重损伤ATP生成和中间物质生成，并可能导致细胞色素c和活性氧等因素诱导细胞死亡[39,50-52]。当种子生活力低于拐点时，结构和功能完整的线粒体数量极少，且无法提供种子萌发所需的能量，且氧化损伤进一步加剧，生理功能发生严重紊乱，从而促进种子生活力丧失进入骤降期。

基于拐点理论的生理生化基础，发掘出可作为种子生活力拐点的预警指标，包括氧化损伤指标，如醇、醛、酮等挥发性物质组分含量，抗氧化酶的蛋白表达量（APX和过氧化氢酶），羰基小分子醛（4-羟基-E-2-壬烯醛和丁烯醛）含量，关键蛋白（MnSOD、HSP70、APX等）羰基化修饰水平；线粒体损伤指标，包括线粒体膜系统结构、耗氧呼吸水平、电子传递途径关键蛋白（细胞色素c和交替氧化酶）表达量等，以及在骤降期无法分离纯化出线粒体。种子衰老拐点的生物学机制及其特征指标的揭示，为研发种子生活力监测预警技术提供了重要理论依据。

3 复份安全保存机制

复份安全保存是指已保存的种质在物理空间或保存方式上再备份保存一份，以防止意外事故而导致资源无法挽回的损失。复份保存即选择另一种质库作为原种质库资源保存的备份库，而这两个种质库之间应有一定的空间距离，以避免战争或自然灾害可能给种质资源造成的毁灭性损失。备份保存不仅包括种子实物的复份安全保存，也应包括相对应资源信息的复份安全保存。备份种质库应选择在贮藏条件较好，且受地震、洪水、泥石流等自然灾害危害可能性最低的地区。国际上认为理想的途径是选择国外一个种质库作为备份保存库。因此，FAO资助挪威政府在Svalbard群岛上建设了容量为450万份的保存库，取名为“全球种质库”（Svalbard Global Seed Vault），作为国际上的种质资源备份保存库[14]。

复份保存资源主要是长期库保存的种质材料，主要采用黑箱（black-box）方式，即将准备进行复份保存的种子样品装在箱子里，外加密封条。未经种质寄存人的允许，复份库保管人不允许开箱动用复份保存的种质材料。对于复份保存的种子，装箱包装前同样要进行种子入库前处理加工，如生活力检测和干燥包装。此外，作为复份保存的黑箱应选择耐低温且结实的材料制作，如铁皮箱，要确保在运输和贮藏过程中不易被撞裂。

4 展望

双低理论和拐点理论是种质安全保存延长保存寿命和维持遗传完整性的理论基础。因此，仍需进一步加强安全保存理论的基础研究，为构建延长种子安全保存寿命技术、生活力监测预警技术、繁殖更新技术等安全保存关键技术提供更好的科学依据。

4.1 加强贮藏前种子质量对延长种质保存寿命的生理生化基础研究

利用低温库保存种质的重要目标之一是最大限度地延长种子保存寿命。在保存条件（温度、含水量和包装方式）已经确定的情况下，提高贮藏前的种子质量是进一步延长保存寿命的关键要素。因此，有必要加强对田间繁殖环境（栽培密度、水肥管理）和成熟收获气候环境（适宜繁殖地区和季节）等影响贮藏前种子质量的因素及其延长保存寿命的种子生理生化机制开展深入研究，进一步构建可延长种质保存寿命的贮藏前种子质量指标和生理生化指标。

4.2 加强种质衰老拐点生物学机制研究

低温库种子生活力丧失存在骤降的特性，但影响生活力丧失特性的因素十分复杂，各类型（育成品种和地方品种，国内收集和国外引进、种子收获的成熟度和批次）作物种子生活力丧失和衰老拐点出现的生物学机制研究较少。因此，有必要加强各类型种质衰老拐点的生物学机制研究，构建可预示和预警衰老拐点的生物学指标。

4.3 加强遗传原真的维持机制研究

种质保存的重要目标是保持种质的遗传完整性，即一份材料内遗传变异的总和。由于一份种质内不同种质型材料的耐贮性可能不同，地方品种（混合群体）尤甚，因此，为了维持后代种子的群体遗传组成不变，繁殖地、群体量、授粉方式、更新次数等是维持遗传原真的关键繁殖更新指标。然而，目前上述繁殖更新指标对遗传完整性的影响机制研究较为薄弱，导致各种质库采用的繁殖更新指标和技术没有统一标准。因此，有必要加强种质类型、更新群体量、更新次数对群体遗传组成影响的机制研究，构建遗传原真的繁殖更新指标体系。

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The Progress and Prospects of the Theoretical Research on the Safe Conservation of Germplasm resources in Genebank

YIN GuangKun, XIN Xia, ZHANG JinMei, CHEN XiaoLing, LIU YunXia, HE JuanJuan, HUANG XueQi, LU XinXiong

Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

The safe conservation of germplasm resources is the core of high-level protection and a prerequisite for sustainable utilization. Low-temperature genebank is the most important way to conserve crop germplasm resources. These aims, extending the conservation longevity, maintaining the genetic integrity and preventing the accidental loss, always were the research difficulties and hotspots in the safe conservation. This review systematically sorted out the research history of germplasm resources in genebanks in the past 100 years, and pointed out: (1) Low moisture content and low storage temperature are key factors for prolonging seed longevity, forming the low temperature and moisture theory, which is the theoretical basis for safe conservation in genebanks; (2) The declining viability of seeds in genebanks has the characteristic of the critical node, which is the lower limit for maintaining genetic integrity, forming the critical node theory, which is the theoretical basis for the safe conservation of germplasm resources; (3) The conserved germplasm should be backed up by the physical space or storage method, forming the back up conservation mechanism, which is the a safeguard measure to prevent the irreversible loss of resources caused by accidents. This review focused on the connotation, significance and practical guidance of the double-low theory, the critical node theory and the duplication conservation mechanism, in order to further promoting the development of the safe conservation of germplasm resources.

genebank; safe conservation; low temperature and moisture theory; critical node theory; back up conservation mechanism

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.07.001

2021-10-14；

2021-11-25

中国农业科学院科技创新工程

尹广鹍，E-mail：yinguangkun@caas.cn。通信作者卢新雄，E-mail：luxinxiong@caas.cn

（责任编辑 李莉）