益生菌对鱼类黏膜免疫影响的研究进展

■徐 晴 李若铭 王桂芹

（吉林农业大学动物科学技术学院，动物 生产及产品质量安全教育部重点实验室，现代 农业技术教育部国际合作联合实验室，吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林 长春 130118）

益生菌在人类和畜禽方面广泛使用，大量研究表明，益生菌具有防治多种疾病的功效。益生菌在水产养殖中的使用尚处于初级阶段，相关的机制探索较为有限。黏膜免疫系统具有多种独特的先天和适应性免疫细胞和分子，在抵御有害物质入侵时发挥重要作用。近些年，人们对鱼类等水产动物的黏膜免疫系统进行了研究，表明了黏膜免疫作为主要防御系统的重要性。文章综述了鱼类的黏膜结构及益生菌对鱼类黏膜免疫系统影响的研究进展，并对今后鱼类的黏膜免疫和益生菌研究进行了展望。

1 益生菌

1.1 益生菌的概念

益生菌是一类能在体内存活，定植在肠道、生殖系统等对宿主有益的活性微生物，是能产生确切健康功效从而调节宿主微生态平衡、发挥对机体有益作用的活性有益微生物的总称。益生菌用于调节机体微生态平衡，增强动物对有害微生物的抑制作用或通过影响非特异性及特异性免疫反应，调节黏膜屏障及免疫平衡，抑制肠道炎症，提高应激抗病能力，同时能提供营养物质，促进营养物质的消化吸收，提高动物代谢能力等功能。

1.2 常见益生菌种类

益生菌种类繁多，2013年我国农业部第105号公告《允许使用的饲料添加剂品种目录》中公布了可用的微生物种类（见表1），规范了我国水产动物益生菌的使用。根据益生菌的来源、使用目的、施用方式和施用鱼种的不同，益生菌菌株的选择多种多样。益生菌种类主要有乳酸菌（Lactic acid bacteria）、芽孢杆菌（Bacillus）、酵母菌（Yeasts）和光合细菌（Photosynthetic Bacteria）等，为水产适用益生菌提供多种选择。

表1 农业部第105号公告公布饲料中允许添加的微生物种类

2 黏膜结构

黏膜免疫系统（mucosal immune system，MIS）又称黏膜相关淋巴组织（mucosa-associated lymphoid tissue，MALT），是指黏膜固有层和上皮细胞下散在的无包膜的淋巴组织，是适应性免疫细胞产生和成熟的重要部位之一。存在于动物胃肠道、口腔通道、鼻咽道、甲状腺、乳腺、肺、唾液腺、眼睛和皮肤等黏膜部位，而水产动物生活在水中，其黏膜免疫系统包括鳃相关淋巴组织（gill-associated lymphoid tissue，GIALT）、皮肤相关淋巴组织（skin-associated lymphoid tissue，SALT）和肠道相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissue，GALT）。在水产动物黏膜器官中没有发现Peyer氏淋巴结和扁桃体等有组织的淋巴结构，但这些器官中存在弥漫的淋巴细胞。水产动物黏膜中含有多种免疫细胞，且富含多种免疫相关因子（如凝集素、黏蛋白、抗菌肽及免疫球蛋白等），在非特异性免疫和特异性免疫应答中发挥重要作用。这些黏膜表面覆盖具有保护性的免疫黏液层，使黏膜免疫系统在防御病原侵袭感染的第一道防线上发挥重要作用。

2.1 肠黏膜相关淋巴组织

GALT 是肠道免疫系统的统称，是许多病原体的重要进入口岸。在鱼类的肠黏膜中富含免疫细胞，如淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞（肥大细胞）和巨噬细胞。肠道黏膜上皮内淋巴细胞主要为参与细胞免疫的T细胞，使用几种识别T细胞标志物的抗体，在鲤（Cyprinus carpio）和黑鲈（Dicentrarchus labrax）的肠道上皮层中都检测到了大量的T细胞。鲤后肠组织中，IgT+B 细胞在黏膜固有层和黏膜上皮细胞层都有分布，但在黏膜固有层中的出现较晚，而虹鳟（Oncorhyn⁃chus mykiss）IgM+和IgT+细胞在整个肠道内均可检测到。多聚免疫球蛋白受体pIgR 介导细胞内多聚免疫球蛋白的转运在黏膜免疫中发挥重要作用，在红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）中利用原位杂交技术检测到pIgR 在肠上皮细胞中大量分布，鲤pIgR 主要位于肠上皮细胞和黏液细胞的细胞核附近，以及肠上皮和固有膜内的淋巴样细胞中。肠道中含有大量的免疫细胞证明了肠黏膜是机体黏膜免疫防御的主要部位。

2.2 皮肤黏膜相关淋巴组织

鱼的皮肤由于缺乏角质化而被覆盖一层黏膜层，皮肤黏液是防止感染、干燥和接触伤害的第一个物理、化学和生物屏障。皮肤或表皮层由上皮细胞、黏液细胞、棒状细胞、杯状细胞等大量的免疫活性细胞组成，这使得皮肤免疫防御变得复杂。T 细胞和B 细胞是机体免疫的主要参与者，利用T细胞和B细胞标志物抗体的检测表明，虹鳟和鲤的皮肤表皮中含有丰富的B细胞和T细胞。类树突状细胞已在虹鳟皮肤中被发现，其功能特征与哺乳动物的树突状细胞亚群相似，均能诱导T淋巴细胞活化和增殖。皮肤的B细胞免疫应答与肠道十分相似，肠道黏膜免疫中的特殊免疫球蛋白IgT同样在皮肤免疫中发挥关键作用。罗非鱼（Oreochromis niloticus）皮肤黏液中的IgT 由皮肤组织中IgT+B细胞分化产生的浆细胞分泌，并且经过迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella Tarda）浸泡后皮肤中IgT表达上调，提示IgT 经转运至皮肤黏液并在罗非鱼的黏膜免疫中起主导作用。

2.3 鳃黏膜相关淋巴组织

鳃是水生动物的呼吸器官，是各种病原体入侵的重要部位，同时鳃上还覆盖着黏液，通过含有巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞（肥大细胞）的黏膜相关淋巴组织参与免疫防御。在鳃细丝底部的鳃间隔处具有与哺乳动物黏膜中描述的类似的淋巴细胞聚集体（T细胞），T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，说明鳃参与了机体的黏膜免疫防御。

3 益生菌对鱼类黏膜免疫的影响

3.1 益生菌对GALT的影响

肠道是益生菌的主要靶器官，而益生菌能对肠道形态产生影响，因此，与益生菌有关的肠道免疫研究值得高度重视。Xia等（2018）在罗非鱼饲料中添加鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）和乳酸乳杆菌（Lactococcus lactis）增加肠微绒毛长度和密度，同样Standen 等（2015）添加含有其他不同的多种益生菌饲喂罗非鱼后，改善了罗非鱼微绒毛密度和微绒毛长度，增加肠道吸收表面积。Sewaka等（2019）研究还发现鼠李糖乳杆菌和菊芋（Helianthus tuberosus）增加了红罗非鱼（red tilapia）肠道的绒毛高度和绒毛宽度，从而增加肠道吸收面积的，影响血清中的血糖、总胆固醇和总蛋白水平。较高的微绒毛密度会减少肠细胞之间紧密连接的暴露，这有助于提供一种更有效的屏障来抵御潜在的病原体。益生菌可通过改善肠道微观形态改善肠道健康促进免疫调节。

益生菌除了对肠道形态的影响外，还具有调节肠道黏膜细胞生理活动的能力。黏液细胞是肠道黏膜抵御病原菌感染的重要部分。黏液杯状细胞由酸性和中性黏蛋白组成，有助于润滑、捕获和清除病原体。Sewaka 等（2019）饲喂补充了菊芋和鼠李糖乳杆菌的饵料使红罗非鱼的杯状细胞数量明显更高，中性黏液细胞和双色黏液细胞数量显著增加，鱼肠道各部均以酸性黏液细胞为主，IgG 与酸性黏蛋白的黏附有利于其在红罗非鱼肠道定植存活。Standen 等（2016）用商品化的多菌种益生菌饲喂罗非鱼，使其肠中杯状细胞的数量明显增多；在只添加乳酸双球菌的罗非鱼中也使杯状细胞水平升高，提高肠道对致病的抵抗力。鱼胃肠道中的杯状细胞充满了丰富的酸性黏蛋白。肠道黏液对防御屏障至关重要，无论是物理上还是化学上，因为它的功能是捕获和清除病原体，防止它们附着在上皮细胞上。

添加益生菌能使肠道中免疫相关基因的表达水平发生变化。肿瘤坏死因子α（TNF-α）通过诱导炎症反应，将更多的淋巴细胞招募到定居或感染部位，从而促进宿主对细菌定植或入侵的防御机制。Standen等（2013）添加乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）增加了罗非鱼肠道中TNF-α的产生。刘长军（2018）在尼罗罗非鱼饲料中添加植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），与对照组相比，尼罗罗非鱼肠道细胞因子核因子κB（NF-κB）、TNF-α和白细胞介素10（IL-10）的相对表达提高，这表明摄食益生菌的鱼类处于免疫升高的状态，通过改善免疫来帮助其抵抗病原性入侵。研究多菌种益生菌对罗非鱼的影响，结果表明参与产生免疫反应的热休克蛋白HSP70 基因表达显著增加。Xia等（2018）在饲料中添加鼠李糖乳杆菌和乳酸乳杆菌，提高了罗非鱼HSP70 表达，干扰素-γ基因表达水平最高，肠道和肝脏中促炎细胞因子表达增加的鱼类对无乳链球菌的抵抗力增强。GALT受到了益生菌调节而增强了天然免疫力。

3.2 益生菌对SALT的影响

益生菌可改善鱼类的皮肤相关淋巴组织，由于皮肤与环境直接接触，是鱼类最主要和最大的黏膜防御系统之一，因此，有关益生菌对皮肤淋巴组织的研究具有重要意义。水产动物的皮肤与哺乳动物的皮肤并不相同，但在发育、结构和保护功能方面有相似之处。Das等（2013）选用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus Amy⁃loliquefaciens）对鲤进行了试验，饲喂三个水平的包被益生菌饲料，对全身和皮肤黏膜免疫应答表现出不同水平的影响作用，对皮肤黏液中的溶菌酶、过氧化物酶和总蛋白含量均有显著提高。Hoseinifar 等（2015）添加嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）饲料，使剑尾鱼（Xiphophorus helleri）皮肤黏液中的抗菌活性随给药剂量的增加而增强，呈剂量依赖关系，且喂食益生菌使鱼类皮肤黏液蛋白水平升高，皮肤黏液杀菌活性和可溶性蛋白水平的提高可以改善使用益生菌后的免疫反应。Van 等（2018）从尼罗罗非鱼的胃肠道中分离出来两种益生菌；Kuebutornye 等（2020）选用三种芽孢杆菌，联合添加至尼罗罗非鱼饲料中，皮肤黏液免疫指标显著增加，益生菌的协同作用刺激了黏膜免疫的应答。益生菌及其衍生物质可以在黏膜上皮局部发挥作用，或者如果他们渗透到宿主的循环或刺激免疫细胞从黏膜部位移动到全身淋巴组织，就可以在局部或系统内发挥作用。Hoseinifar 等（2019）在鲤幼鱼饲料中添加单独或混合的乳酸片球菌和棉籽糖，补充后免疫能力提高，显著增加了皮肤黏液总免疫球蛋白（Ig），提高皮肤黏液蛋白酶活性，编码溶菌酶的基因在皮肤中的表达上调，可归因于SALT的调节，表明益生菌对先天免疫反应有免疫调节作用。Guo 等（2020）通过野生捕捞鱼类肠道中分离到的肠系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）对免疫相关基因的上调作用，激活了大菱鲆（Scophthalmus maximus）皮肤黏膜免疫功能。益生菌可刺激皮肤黏膜免疫的应答，调节皮肤黏液蛋白及免疫因子，提高免疫力。

3.3 益生菌对GIALT的影响

鳃上覆盖着黏液，以保护其免受入侵的病原体的侵袭，但相关研究较少，是因为饲料补充是益生菌最常见的添加方式。在投喂含有益生菌的饲料后，鳃与益生菌的接触变得最小。如果所投细菌对鳃黏膜有很高的亲和力，在养殖水体中直接添加益生菌会更好地增加与鳃的接触。王淼等（2017）研究中发现，健康尼罗罗非鱼皮肤和鳃黏附细菌存在相同的优势菌群，主要为特吕珀菌属（Truepera）、硫杆菌属（Thiobacil⁃lus）、弓形杆菌（Arcobacter）、海单胞菌属（Marinomo⁃nas）和弧菌属（Vibrio）。人工感染无乳链球菌后，鱼的鳃黏膜共生菌菌群多样性下降。Wang等（2020）在水中添加益生菌蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）能提高尼罗罗非鱼鳃中的碱性磷酸酶活性，且这两种益生菌不会在罗非鱼的鳃中定植，而定期投放时，它们会影响罗非鱼特定组织的水质、微生物区系和免疫酶活性。Mohapatra 等（2012）在饲料中添加多种益生菌混合物投喂南亚野鲮（Labeo rohita），益生菌可以减轻氰戊菊酯的鳃相关坏死效应，可保持鳃的组织结构完整，并促进氰戊菊酯暴露期间鳃细丝的再生。益生菌直接添加到水体中能更好地与鳃接触，保护了鳃相关淋巴组织。

3.4 益生菌对黏膜表面微生物区系的影响

益生菌不仅对局部黏膜免疫有直接影响外，且对黏膜表面的共生微生物区系也有一定的影响。共生微生物区系不能被认为是黏膜相关淋巴组织的一部分，而共生微生物区系在黏膜相关淋巴组织的发育和正常功能中是必不可少的。添加益生菌可以增加潜在有益细菌的数量，减少有害微生物的数量，所以益生菌对黏膜表面微生物区系的研究具有重要意义。Wang等（2020）在水中添加益生菌蜡样芽孢杆菌和粪产碱杆菌，发现尼罗罗非鱼黏膜免疫器官共享一个核心微生物群，其中鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）在这些器官中比在水和沉积物中相对丰富得多，为进一步研究其在黏液中的功能提供了依据。然而，相对丰富的属不受益生菌处理的影响。Xia 等（2018）研究发现，罗非鱼的优势菌群是梭杆菌门（Fusobacteria）、变形杆菌（Proteobacteria）、放线杆菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes），在添加鼠李糖乳杆菌和乳酸乳杆菌后增加了变形杆菌的分布，减少了梭杆菌、拟杆菌和放线菌的数量，且单独使用乳酸乳杆菌进一步丰富了厚壁菌门。Mirghaed等（2018）单独或联合使用可发酵纤维和益生菌提高了里海白鱼（Rutilus fresii kutum）鱼种总原生肠道菌群和原生乳酸菌水平。Guo 等（2020）通过野生捕捞鱼类肠道中分离到的肠系膜明串珠菌菌株HY2对大菱鲆肠道微生物区系结构具有调控作用，能够增强免疫应答和优化肠道菌群的结构和多样性。黏膜表面微生物区系组成多样性与黏膜相关淋巴组织具有相关性，施用益生菌来调节黏膜表面微生物区系的组成，从而影响黏膜免疫系统。

4 小结

MALT 是抵御外界环境有害物质的第一道屏障，是机体产生免疫应答的重要部分。近些年，随着集约化养殖的发展，黏膜免疫系统面临着各种病原体的入侵，威胁着水产动物的健康生长，益生菌作为饲料添加剂，能提高黏膜屏障，调节微生物比例和提升黏膜免疫状态，益生菌及产品在水产养殖行业占有举足轻重的地位。但益生菌对黏膜免疫系统的研究仍十分有限。今后的研究将集中为寻找合适的多功能益生菌，探索益生菌不同的添加方式和不同用量对黏膜相关淋巴组织的影响，深入研究益生菌作用黏膜免疫系统的相关机制。随着研究的逐步深入，益生菌对黏膜免疫的影响及相关机制会被进一步揭示，在禁抗的大背景下，将有助于开发更多的渔用益生菌产品，推动水产养殖业向着更为绿色健康的方向发展。