气管镜下宏基因组学二代测序技术在肺癌鉴别诊断中的临床应用价值

米 婷，王雅宁

(1.西安医学院附属宝鸡医院呼吸与危重症医学科，陕西 宝鸡 721000； 2.宝鸡市第二人民医院呼吸内科，陕西 宝鸡721004)

肺癌 (Lung cancer,LC)，作为一种医学上严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其具有较高的发病率及病死率。由于其起源于肺部支气管黏膜，也被称为原发性支气管肺癌 (Primary bronchogenic carcinoma,PBC)。有研究显示，女性肺癌的发病率已超过乳腺癌发病率，占据恶性肿瘤发病率的第二位，仅次于男性肺癌的发病率[1-3]。肺癌患者早起发病时临床症状并不明显，这就导致患者确诊时大都处于晚期状态，错过了最佳治疗时间。不可否认，近段时间以来，许多研究者进行了大量的实验研究并发现了不少新的诊断方法和治疗手段，但是肺癌的治疗效果并没有达到预期的效果，其近五年来生存率约17%，这说明我国治疗肺癌的水平仍处于较低水平[4-8]。随着医疗技术的不断发展，气管镜由于操作方便在临床上的应用越来越广泛，尤其是在肺部疾病的治疗中，同时也进一步提高了肺部疾病的诊断率[9-10]。

相关文献报道显示，肺癌的发生不仅是由环境外因导致的，遗传、机体炎症以及体内微生物菌群等人体内因一定程度上也对其发生起着作用[11-12]，某些特定的细菌与癌症的发生密切相关。人体微生物菌群作为一个庞大的基因组，其能够达到人体自身基因组的100倍，能够维持人体内环境平衡，从而保证生命安全[13-15]。随着医疗技术的快速发展，宏基因组学检测在基因组学检测中发挥的作用越来越大，也向我们展现了菌群的基因多样性，越来越多的人尝试采用宏基因组学去探究人体菌群与各类疾病之间的相关性。近几年来，大量研究表明，人类的饮食习惯以及生活习惯(吸烟、饮酒)很大程度影响着自身的菌群结构，而这些习惯往往容易致癌，因此，我们有理由相信菌群与癌症发展之间存在一定的联系。本研究通过运用支气管镜活检探究宏基因组学二代测序技术诊断肺腺癌的临床应用价值，旨在为肺癌的诊断方法提供新的可能，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2019年9月至2020年2月西安医学院附属宝鸡医院诊治的进行支气管镜检查的患者中选择32例肺癌患者(M组)，20例肺部非肺癌肺部疾病患者(MN组)和18例健康人群作为对照组(N组)。M组患者男17例，女15例，年龄42～58岁，平均(49.67±5.98)岁；MN组患者男11例，女10例，年龄44～60岁，平均(47.58±6.14)；N组患者男10例，女8例，年龄40～57岁，平均(48.39±5.62)岁。收集所有受试者的病史，并于术前对患者进行心电图检查、各项肺功能检查、血常规和凝血功能检查以及相关影像学检查。三组患者年龄、性别等一般资料比较无统计学差异(均P<0.05)，具有可比性。①健康对照组病例纳入标准：身体状况良好；无其他恶性肿瘤、脑部疾病及心脏疾病患者；无肺部相关手术史患者；没有哮喘、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD) 或其他慢性气道疾病病史和非病理性呼吸道表现；患者在支气管镜检查前没有接受过化疗、放疗、手术或其他肺癌治疗。排除标准：合并有免疫系统疾病、内分泌系统以及血液系统疾病患者；检查前3个月内使用过抗生素患者；行胸片检查有疑似肺部病变；不适合进行支气管检查患者。②非肺癌肺部疾病组病例纳入标准：无其他恶性肿瘤、脑部疾病及心脏疾病患者；无肺部相关手术史患者；患者存在肺癌之外的肺部疾病。排除标准：患者经病理学检查疑似存在肺癌；检查前3个月内使用过抗生素患者。③肺癌患者研究组病例纳入标准：确诊为肺腺癌患者；无其他恶性肿瘤、脑部疾病及心脏疾病患者；无肺部相关手术史患者。排除标准：经病理确诊为非肿瘤；术前3个月内使用过抗生素患者。本研究已经由西安医学院附属宝鸡医院伦理学会批准，所有患者及家属均了解此次研究情况，并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 咽拭子采样方法：患者取坐位，取灭菌棉拭子越过舌根缓慢伸入咽后壁以及扁桃体侧壁，旋转擦拭一周，收集黏膜细胞，取出棉拭子时避免碰触舌头、悬垂体、口腔黏膜以及唾液。将棉拭子头部放入灭菌冻存管中，与-80 ℃进行保存。检测之前为了增加微生物的附着率，需使用无菌生理盐水浸湿棉拭子。

1.2.2 肺泡灌洗液收集方法：研究对象在进行支气管镜检查之前，为确保患者安全，需采用雾化剂进行局部麻醉处理，之后使用咪达唑仑与芬太尼进行镇静处理。将支气管镜从鼻腔插入，经咽喉到达气管和支气管。在支气管镜达到舌叶或中叶开口处时，注射适当的利多卡因进行麻醉，紧接着将60 ml 0.9%的氯化钠溶液注入管腔进行灌注，回收率≥30%时认定为样本合格，收集得到的肺泡灌洗液进行后续检测。

1.2.3 DNA 提取及测序：使用珠打法从气道样品中分离细菌 DNA。使用巢式 PCR 对细菌16S rRNA的 V3-V4区域进行扩增。使用 Miseq 平台对扩增子进行测序。使用 USEARCH 8.0 从原始数据中提取干净的数据。 使用 UPARSE 去除嵌合序列后，基于 97% 的相似性对操作分类单元(Operational taxonomic units，OTU)进行分类。通过 RDP 分类器针对 Silva (SSU 123) 16S rRNA 数据库在使用 70% 的置信阈值的基础下对每个 16s rRNA 基因序列的系统衍生的从属关系进行分析。

1.2.4 观察以及评价指标：①采用shannon 指数和Simpson指数来比较不同组别研究对象咽部以及肺泡灌洗液微量菌群组间分类的多样性的差异；②比较三组对象在菌门分类等级上的物种丰度差异；③采用准确率和精度作为评价性指标来衡量肺泡灌洗液中不同菌属对鉴别肺癌的诊断价值的真实性。

2 结 果

2.1 三组研究对象咽部以及肺泡灌洗液微量菌群多样性比较 对于咽部微量菌群而言，N组与MN组患者Shannon、Simpson指数分别比较均无统计学差异(均P>0.05)，与M组患者Shannon、Simpson指数分别比较均有明显降低(均P<0.05)；对于肺泡灌洗液微量菌群而言，M组与MN组患者Shannon、Simpson指数分别比较均无统计学差异(均P>0.05)，与N组患者Shannon、Simpson指数分别比较均有明显升高(均P<0.05)。见表1。

表1 三组研究对象咽部以及肺泡灌洗液微量菌群多样性比较

2.2 三组研究对象在门分类等级上物种丰度差异比较 对于咽部微量菌群而言，常见的菌门分别为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门与梭杆菌门，其中厚壁菌门以及梭杆菌门在物种丰度上比较具有统计学差异，M组与MN组患者厚壁菌门与梭杆菌门丰度比较无统计学差异(均P>0.05)，N组患者厚壁菌门丰度明显较低(P<0.05)，梭杆菌门丰度明显较高(P<0.05)。见表2。对于肺泡灌洗液微量菌群而言，常见的菌门分别为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门、放线菌门与螺杆菌门，其中厚壁菌门、梭杆菌门以及放线菌门在物种丰度上比较具有统计学差异(均P>0.05)，M组与MN组患者厚壁菌门与梭杆菌门丰度比较无统计学差异(均P>0.05)，N组患者厚壁菌门丰度明显较低(P<0.05)，梭杆菌门丰度明显较高(P<0.05)；M组与N组患者放线菌门丰度比较无统计学差异(P>0.05)，MN组患者放线菌门丰度明显较高(P<0.05)。见表3。

表2 三组研究对象咽部微量菌群在菌门分类等级上物种丰度差异比较(%)

表3 三组对象肺泡灌洗液微量菌群在菌门分类等级上物种丰度差异比较(%)

2.3 肺泡灌洗液中不同菌属对鉴别肺癌诊断价值 运用准确度和精度评价诊断由宏基因组学二代测序技术预测出的鉴别肺癌价值较高的三个菌属葡萄球菌属、链球菌属和硒单胞菌属，见图1、2。

图1 葡萄球菌属、链球菌属和硒单胞菌属诊断肺癌准确度

图2 葡萄球菌属、链球菌属和硒单胞菌属诊断肺癌精度

3 讨 论

在我们的研究中，我们对肺癌患者的咽部以及肺泡灌洗液进行了采样，并将它们与来自配对的非癌侧的样本以及来自“健康”对照的样本进行了比较。 我们的分析表明，肺癌患者体内的微生物群落与“健康”对照组的微生物群落是有区别的，肺癌患者肺微生物群组成的改变不仅限于癌组织。据我们所知，我们第一次记录了链球菌属在肺癌患者中的含量丰富，并表现出中等分类潜力。此外，其他重要发现包括链球菌属在肺癌患者中较高，而葡萄球菌在“健康”对照中更高。还观察到样本中气道微生物群谱从“健康”对照到非癌区域到配对癌区域的逐渐“转变”。这些数据为了解下呼吸道微生物与肺癌的关系提供了初步见解，并强调了呼吸道失调与肺癌之间的相互影响。到目前为止，三项使用下一代测序的研究表征了肺癌患者的肺微生物组。在对中国 8 例从不吸烟女性肺癌病例和 8例从不吸烟女性对照的痰液取样进行的小规模研究中，在肺癌病例中观察到链球菌属、链球菌属水平显著富集[16-18]。在我们的研究中，病例组中链球菌属始终丰富，与我们的发现一致。 然而，后一组中两组在多样性上没有差异。异质性可能与地域和种族差异、方法学差异以及样本类型的代表性或分组设计的合理性有关。 最近，对肺微生物组进行了迄今为止规模最大的研究，其中包括微生物分析中的 165 个非恶性和 31 个配对肿瘤样本[19]。配对肿瘤的多样性降低也与我们的结果一致。我们的研究为表征肺癌患者非恶性肺组织的肺微生物组提供了有力的依据。 然而，非恶性组织和配对肿瘤样本的比较仅限于肺癌患者的细菌多样性分析，我们的研究缺乏与健康对照受试者的肺微生物组的比较，这限制了定义肺微生物作用的能力。在我们的研究中，与来自对照组的样本相比，来自癌变部位的下呼吸道样本具有显着较低的群落多样性。 这一发现与前两项使用痰和肺组织样本对肺癌微生物群落进行的研究相一致。细菌多样性的一致差异表明，在某些疾病条件下，气道微生物群可能在数量和质量方面发生变化[20]。 这些发现可以结合到“癌症卫生假说”中，以假设癌症发病率的增加可能与卫生条件的增加/特定微生物接触的减少有关，类似于已知的自身免疫性疾病和过敏症[21]。 然而，我们不能完全排除替代假设，即观察到的多样性变化可能只是肿瘤进展的被动副产品。

本研究探索气管镜下宏基因组学二代测序技术在鉴别诊断肺癌的临床应用价值。采用宏基因组学二代测序技术分析三组研究对象咽部的菌群特征，对三组研究对象上呼吸道菌群与下呼吸道菌群的差异进行了比较分析；同时通过对肺癌患者进行代谢组学分析，找出了临床上肺癌患者确诊的潜在标志物。结果显示，宏基因组学二代测序技术用来预测诊断肺癌是有一定运用价值的。葡萄球菌属、链球菌属和硒单胞菌属可作为肺癌诊断的潜在标志物。本文的不足之处在于研究对象数目较少，结果偏单一，使结果容易产生误差，以后的研究扩大研究范围是有必要的。