白豆蔻精油超临界CO2萃取工艺优化及挥发性成分分析

马 钤，郭川川，张峰轶，李 镓，杨壹芳

（四川天味食品集团股份有限公司，四川 成都 610200）

白豆蔻（Amomum cardamomum）为芭蕉目姜科豆蔻属植物白豆蔻的果实，可药食兼用。按产地不同分成国产豆蔻和进口豆蔻。气味苦香，味道辛凉微苦，烹饪中可去异味、增辛香，常用于卤水以及火锅等[1-2]。目前，国内外白豆蔻精油的提取方法主要有水蒸气蒸馏萃取（steam distillation extraction，SDE）法[3-4]、微波辅助萃取（microwave assisted extraction，MAE）法[5]、超临界流体萃取（supercritical fluid extraction，SFE）法等[6-7]。水蒸气蒸馏提取精油香气浓郁，但几乎无滋味物质，并且提取得率较低，导致价格昂贵。微波萃取法是指使用适当的溶剂在微波反应器中从植物、矿物、动物组织等中提取各种化学成分的技术和方法。微波是指频率在300 MHz至300 GHz的电磁波，利用电磁场的作用使半固体或固体物质中的某些有机物成分与基体有效的分隔，并能保持分析对象化合物状态不变[8]。其主要优点是应用面广、消耗样品少、提取时间短、操作简单，但需要借助有机溶剂，导致后期可能存在溶剂残留。而超临界CO2提取法作为一种绿色的、重要的工业化精油生产方法[9]，使用CO2提取的精油无化学污染，并且萃取能力强、提取率高，操作温度较低，能防止热敏性物质的功能性被破坏[10]，但由于其设备昂贵，还未在白豆蔻精油的工业化生产上普遍应用。因此，本试验选取超临界流体萃取（SFE）法进行研究，对萃取压力、萃取温度、萃取时间、CO2流量4个因素进行单因素试验研究，并根据单因素试验结果进一步进行了正交试验，获得白豆蔻精油最佳生产工艺参数，并将最优工艺条件下生产的白豆蔻精油采用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其组成，并用水蒸气蒸馏法（SDE）加以对比，从而为白豆蔻挥发性成分的进一步研究开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜白豆蔻：印度尼西亚；CO2（纯度＞99.9%）、氦气（He）（纯度＞99.99%）：成都科源气体有限公司。

1.2 仪器与设备

3P多功能热泵干燥车间：广东凯能电器科技有限公司装置；WFJ-60食品香料粉碎机：江阴市普友粉体设备有限公司；HA231-50-25超临界萃取装置：南通华安超临界萃取设备公司；Agilent 9000气相色谱仪、5977B 质谱仪：美国安捷伦公司；THT-4挥发油提取缩罐冷凝装置：北京国卫和教医药设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白豆蔻粉预处理

新鲜白豆蔻置于多功能热泵干燥车间中，设置温度60 ℃连续干燥，调节水分约至12%。干燥好的白豆蔻用食品干燥粉碎机粉碎，过40目筛。制得白豆蔻粉于常温（25 ℃）干燥储藏。

1.3.2 超临界CO2萃取工艺优化单因素试验

萃取压力的确定：称取600 kg粉碎后的白豆蔻，装入萃取罐中，分别设置萃取压力为25 MPa、30 MPa、35 MPa、40 MPa、45 MPa，固定设置萃取温度为40 ℃，萃取时间3.5 h，萃取流量12 mL/min，解吸压力6 MPa，解吸温度65 ℃，研究萃取压力对精油得率的影响。

萃取温度的确定：称取600 kg粉碎后的白豆蔻，装入萃取罐中，设置萃取压力为25 MPa，分别设置萃取温度为40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃，萃取时间3.5 h，萃取流量12 mL/min，解吸压力6 MPa，解吸温度65 ℃，研究萃取温度对精油得率的影响。

萃取时间的确定：称取600 kg粉碎后的白豆蔻，装入萃取罐中，设置萃取压力为25 MPa，萃取温度为40 ℃，分别设置萃取时间3.5 h、4.0 h、4.5 h、5.0 h、5.5 h，萃取流量12 mL/min，解吸压力6 MPa，解吸温度65 ℃，研究萃取时间对精油得率的影响。

CO2流量的确定：称取600 kg粉碎后的白豆蔻，装入萃取罐中，设置萃取压力为25 MPa，萃取温度为40 ℃，设置萃取时间3.5 h，分别设置萃取流量为8 mL/min、10 mL/min、12 mL/min、14 mL/min、16 mL/min，解吸压力6 MPa，解吸温度65 ℃，研究CO2流量对精油得率的影响。

1.3.3 超临界CO2萃取工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，以挥发油萃取得率为评价指标，考察4个因素（萃取压力、萃取温度、CO2流量和萃取时间）对白豆蔻精油得率的影响。设置L9（34）试验设计进行4因素3水平正交试验，以确定最佳提取工艺。正交试验因素与水平见表1。

表1 超临界CO2萃取工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for supercritical CO2 extraction process optimization

1.3.4 水蒸气蒸馏法提取白豆蔻精油

取150 kg白豆蔻加入500 L浓缩罐中，以300 L蒸馏水为溶剂，浸泡3 h后通入冷凝水，加热回流4 h，停止加热，自然冷却至室温。从挥发油提取装置中收集白豆蔻挥发油，称量，记录数据，平行试验3次，精油得率计算公式如下：

1.3.5 GC-MS分析

采用气质联用法，分析不同条件提取的白豆蔻精油的挥发性物质。GC-MS条件和参数如下：AgilentJ&WDB-WAX色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm），载气为高纯氦气（He），流速1 mL/min，分流进样（分流比20∶1），升温程序：起始温度50 ℃，从10 ℃/min升至160 ℃，保持2 min；以8 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。扫描范围35～600m/z。利用Mass Hunter工作站，美国国家标准技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）17质谱库检索鉴定各种化学成分，按峰面积归一化法确定各组分的相对含量。

1.3.6 数据处理

实验样品均有3次以上独立重复，所有数据采集均使用Microsoft Office Excel 2010统计。正交试验采用SPSS 2.0软件设计分析。差异显著性分析采用数据处理系统（data processing system，DPS）7.5，P＜0.05认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 萃取工艺优化单因素试验

2.1.1 超临界CO2萃取压力对白豆蔻精油得率的影响

压力是影响CO2超临界萃取的关键因素之一。随着超临界流体压力的增加，不同化合物的溶解度普遍急剧增加。特别是在临界压力附近，各种化合物的溶解度参数的增加值可达到两个数量级以上。研究发现超临界的溶解能力与压力的关系可用超临界流体的密度表示，其溶解能力一般随着密度的增加而增加[11-12]。在临界点附近，压力对密度的影响特别明显，流体的密度随压力的增加而迅速提高，溶解度增加效应越大。超过此范围则压力对密度增加的影响变小，溶解度增加效应也趋于缓慢。当底物以及其他因素一定时，随着压力的进一步增大，精油得率不再增加。

CO2超临界萃取压力对白豆蔻精油得率的影响结果见图1。由图1可知，随着萃取压力在25～45 MPa范围内的增加，白豆蔻精油得率总体有先上升后下降的趋势。当萃取压力在25～30 MPa时，白豆蔻精油得率显著增加（P＜0.05）；当萃取压力在30 MPa时，白豆蔻精油得率最高，为6%；当萃取压力＞30 MPa之后，白豆蔻精油得率呈缓慢下降趋势。因此，选择最佳萃取压力为30 MPa。

图1 萃取压力对精油得率的影响Fig.1 Effect of extraction pressure on essential oil yield

2.1.2 萃取温度对白豆蔻精油得率的影响

温度对超临界萃取的影响比压力更为复杂，主要包含两个方面，即温度对超临界流体密度的影响和温度对物质蒸汽压的影响[13-14]。一般来说，随着温度的升高，密度降低，使物质在超临界CO2流体中的溶解度下降。而温度对物质蒸汽压也有一定的影响，随着温度的升高，物质的蒸汽压增大，使物质的溶解度增大。这两个相反的影响导致在一定压力下达到等压溶解度的最低点。在最低温度以下，前者占优势，溶解度呈下降趋势，在最低温度以上，后者占优势，溶解度呈上升趋势。

CO2超临界萃取温度对白豆蔻精油得率的影响结果见图2。由图2可知，随着萃取温度的升高，白豆蔻精油得率总体有先上升后下降的趋势。当萃取温度在40～50 ℃时，白豆蔻精油得率随之显著增加（P＜0.05），且萃取温度由45 ℃升高至50 ℃时的精油得率增长率高于40 ℃到45 ℃；当萃取温度在50 ℃时，白豆蔻精油得率最高6%；当萃取温度在50～60 ℃时，白豆蔻精油得率连续显著降低（P＜0.05）。因此，选择最佳萃取温度为50 ℃。

图2 萃取温度对精油得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on essential oil yield

2.1.3 萃取时间对白豆蔻精油得率的影响

萃取时间对萃取率的影响可以从底物的量与萃取时间的关系来考虑[15-16]。在萃取底物及其他因素一定时，白豆蔻精油最大萃取量是一定的。随着萃取时间的延长萃取率相应增加，但增加的曲线斜率逐渐减小，最后趋近于平缓，所以一般萃取时间控制在一定范围内。

CO2超临界萃取时间对白豆蔻精油得率的影响见图3。由图3可知，随着萃取时间在3.5～4.5 h范围内的增加，白豆蔻精油得率总体有先上升后趋于平缓的趋势。当萃取时间在3.5～4.5 h时，白豆蔻精油得率随之显著增加（P＜0.05）；当萃取时间在4.5 h时，白豆蔻精油得率最高，为5.90%；当萃取时间在4.5～5.5 h时，白豆蔻精油得率不再有显著变化（P＞0.05）。因此，选择最佳萃取时间为4.5 h。

图3 萃取时间对精油得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on essential oil yield

2.1.4 CO2流量对白豆蔻精油得率的影响

流量是萃取过程中的一个经济型指标，也是影响得率的重要因素之一。流量的变化对萃取率的影响应从两方面考虑，即流量对传质速率的影响和流量对萃取时间的影响[17-18]。流量的增加导致萃取器内流速增加，流体与原料的萃取作用时间减少，萃取效率降低；但是，随着流量的增加，与物质间相作用的单位时间流体溶剂增大，新鲜不含精油的流体溶剂，原料中精油物质向容剂中的传质浓度梯度增大，精油向溶剂中的扩散速率提高，从而使萃取速率增大。CO2超临界萃取流量对白豆蔻精油得率的影响结果见图4。由图4可知，随着萃取CO2流量在8～16 mL/min范围内的增加，白豆蔻精油得率总体有先上升后趋于平稳的趋势。当萃取CO2流量由8～12 mL/min时，白豆蔻精油得率随之显著增加（P＜0.05），且萃取CO2流量由10 mL/min增长12 mL/min时的精油得率增长率高于8 mL/min到10 mL/min；当萃取CO2流量在12 mL/min时，白豆蔻精油得率最高，为5.70%；当萃取CO2流量在12～16 mL/min时，白豆蔻精油得率无显著性变化（P＞0.05）。因此，选择最佳萃取CO2流量为12 mL/min。

图4 CO2流量对精油得率的影响Fig.4 Effect of CO2 flow rate on essential oil yield

2.2 超临界CO2萃取工艺优化正交试验设计及结果

在单因素试验的基础上，以挥发油萃取得率为评价指标，考察萃取压力（A）、萃取温度（B）、CO2流量（C）和萃取时间（D）对白豆蔻精油得率的影响，设置L9（34）正交试验设计进行4因素3水平正交试验，正交试验结果与分析见表1。

由表2可知，对结果影响由大到小顺序为萃取压力＞萃取温度＞CO2流量＞萃取时间，最优组合为A1B2C3D1，即萃取压力25 MPa、萃取温度50 ℃、CO2流量14 mL/min、萃取时间4 h。在此最佳萃取工艺条件下进行3次平行验证试验，三次萃取平均白豆蔻精油得率为6.16%，且在此条件下白豆蔻精油的提取率高于正交试验方案中的最高值（6.09%），说明该优化方案是可行的[19-22]。由表3可知，萃取压力对结果影响显著（P＜0.05），萃取温度、CO2流量及萃取时间对结果影响不显著（P＞0.05）。

表2 超临界CO2萃取工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for process optimization by supercritical CO2 extraction

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

2.3 GC-MS分析白豆蔻精油挥发性成分分析

2.3.1 总离子色谱图

两种不同方法提取白豆蔻精油挥发性成分GC-MS分析总离子流色谱图见图5。由图5可知，水蒸气蒸馏和超临界萃取前几个峰的峰型几乎相似，说明两种萃取精油中沸点低的易挥发性物质成分相似。水蒸汽蒸馏挥发性成分的GC-MS图谱中10.766 min的化合物为乙酸松油酯（CAS.80-26-2），超临界CO2萃取中10.790 min的化合物为L-α-松油醇（CAS.10482-56-1），不是同一种物质。

图5 白豆蔻水蒸气蒸馏萃取（a）及超临界CO2萃取（b）提取精油挥发性成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.5 Total ion chromatogram of volatile compounds of Amomum cardamomum essential oil by steam distillation extraction (a)and supercritical CO2 extraction (b) analyzed by GC-MS

2.3.2 两种提取方法提取的白豆蔻精油挥发性化合物分析

两种不同方法提取白豆蔻精油挥发性成分GC-MS分析结果见表4。两种提取方法提取的白豆蔻精油挥发性化合物种类及峰面积对比见表5。由表4及表5可知，两种提取方法提取的白豆蔻精油中共检出挥发性化合物158种，其中水蒸气蒸馏法共检出97种，独有的化合物有47种；超临界萃取法共检出111种，独有的化合物有61种；两种提取法中共有的化合物有50种。水蒸气蒸馏提取法中没有检出茚类，但检出醚类。从检出化合物的种类数量上比较，超临界萃取法中检出了更多种类的挥发性化合物。

表4 白豆蔻精油挥发成分测定结果Table 4 Determination results of volatile components in Amomum cardamomum essential oil

续表

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表5 两种提取方法提取的白豆蔻精油中挥发性化合物种类及峰面积比较Table 5 Comparison of volatile compound types and peak areas in cardamom essential oil between two extraction methods

由表5可知，超临界CO2萃取法样品中总峰面积是水蒸气蒸馏提取法中的2.70倍，其中醇类、烯烃类、醛类、酸类、烷烃类和萘类是峰面积增加的主要挥发性化合物，分别增加了8.07、4.39、8.39、13.07、18.72、16.47倍。从检出化合物的峰面积大小来看，超临界CO2萃取法能提取出更多的挥发性化合物，提取效果更佳。

2.3.3 两种提取方法提取的白豆蔻精油中主要挥发性成分比较

两种提取方法提取的白豆蔻精油中主要挥发性成分对比结果见表6。由表6可知，采用水蒸气蒸馏法共检测出97种挥发性化合物，其中主要的成分有：桉叶油醇、α-蒎烯、4-异丙基甲苯、顺式十五烯酸、棕榈酸、乙酸松油酯等。采用超临界CO2萃取法共检测出111种挥发性化合物，其中主要的成分有：桉叶油醇、棕榈酸、油酸、α-蒎烯、顺式十五烯酸、9（E）,11（E）-共轭亚油酸、4-异丙基甲苯、L-α-松油醇、1-亚甲基-4-（1-甲基乙烯基）-环己烷、蒎烯、（4aS顺式）-2,4a,5,6,7,8,9,9a-八氢-3,5,5-三甲基-9-亚甲基-1H-苯并环庚烯、山萮醇、4-亚甲基-1-（1-甲基乙基）-双环[3.1.0]己烷、Z-11-十六碳烯酸、三十二烷、D-柠檬烯、亚油酸、（1S-cis）-1,2,3,5,6,8a-六氢-4,7-二甲基-1-（1-甲基乙基）-萘、3-苯基-2-丙烯醛等。从检出的主要挥发性化合物种类来看，水蒸气蒸馏为6种，超临界CO2萃取为19种，均包含桉叶油醇、α-蒎烯、4-异丙基甲苯、顺式十五烯酸、棕榈酸5种；超临界CO2萃取法提取的挥发性化合物种类更多，但未检出乙酸松油酯。

由表6可知，从检出的总峰面积来看，超临界CO2萃取是水蒸气蒸馏提取的2.41倍，超临界萃取明显地提升了顺式十五烯酸和棕榈酸的提取率，其峰面积分别是水蒸气蒸馏提取法的6.33、8.78倍。综上所述，用超临界CO2萃取提取白豆蔻精油，效果更佳。

表6 两种提取方法提取的白豆蔻精油中主要挥发性化合物及峰面积比较Table 6 Comparison of major volatile compounds and peak areas in Amomum cardamomum essential oil between two extraction methods

刘金敏等[23]采用顶空固相微萃取法-气质联用技术从白豆蔻中鉴定出了40种成分，其中含量最高的是桉油精（即桉叶油醇），其相对百分含量为32.95%；其次是，烯烃类化合物丰富，相对百分含量为39.12%；王芳[5]使用聚二甲基硅氧烷固相微萃取-气质联用技术分析白豆蔻精油32种挥发性成分，其中主要的化合物有1,8-桉树脑（即桉叶油醇）、β-蒎烯、α-蒎烯、α-松油醇等。张耀华等[25]采用非极性溶剂微波萃取-气相色谱-质谱法测定白豆蔻中的挥发油成分，共鉴定出60种挥发性化学成分，其中主要的化合物为桉油精（即桉叶油醇，70.34%）、β-蒎烯（6.81%）、α-松油醇（3.36%）和α-蒎烯（2.54%）等。张耀华等[25]采用超声波辅助水蒸气蒸馏法提取白豆蔻挥发油进行气质分析，共鉴定出23个化合物，主要包括桉油精（即桉叶油醇，75.16%）、α-蒎烯（1.73%）、β-蒎烯（3.88%）、4-松油烯醇（1.37%）、乙酸松油酯（6.73%）等。以上研究成果中的主要成分，均与本次结果相似，再次验证了本次分析结果的准确性。

3 结论

本研究采用超临界CO2萃取装置对白豆蔻进行萃取，以精油得率为考察指标，在单因素的基础上进行正交试验，通过正交试验得出最佳的萃取条件为：萃取压力25 MPa、萃取温度50 ℃、CO2流量14 mL/min、萃取时间4 h，同时进行水蒸气蒸馏萃取，通过GC-MS对所制备的精油进行分析，白豆蔻精油中主要含有桉叶油醇、α-蒎烯、乙酸松油酯、α-松油醇等挥发性风味物质，超临界CO2萃取法比水蒸气蒸馏萃取法检测出主要挥发性风味物质的含量更高，且检测出的种类更丰富。超临界CO2萃取法应用于白豆蔻精油的提取，效果更优，为白豆蔻的进一步开发利用提供了研究基础。