蚕沙中叶黄素和β-胡萝卜素的含量测定及提取条件优化

郑倩倩，王小芳，路丽娟，张 淼，宋 莎，赵艳普

（石家庄市食品药品检验中心，河北 石家庄 050000）

蚕沙，原名“原蚕屎”，为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx moriLinnaeus的干燥粪便[1]。《本草纲目》曰：“蚕沙用晒干，淘净再晒，可久收不坏”，可治肠鸣，热中消渴，风瘾疹，头风，风赤眼等症，并可用于去风除湿、跌扑伤损[2]。现代药理学研究表明，蚕沙具有抗菌消炎、止血、和胃化湿、抗肿瘤、降血糖的作用，并可用于小儿急性荨麻疹、糖尿病、缺铁性贫血的治疗[3-8]。

蚕沙化学成分丰富多样，包括叶绿素、叶黄素、类胡萝卜素、果胶、黄酮、粗蛋白及微量元素等有效成分[9-10]。叶黄素为一种天然色素，属四萜类化合物，广泛存在于蔬菜、水果、某些藻类生物内，具有保护视觉、预防白内障、增强免疫力、预防动脉硬化等功效[11-13]。β-胡萝卜素属类胡萝卜素，可预防白内障、清除自由基、保护心血管系统，还有抗衰老，提高免疫力等功效[14-16]，具有较高的研究价值。

本研究建立蚕沙中叶黄素、β-胡萝卜素2种成分含量测定的方法，并采用正交设计优化其提取条件，为蚕沙的质量控制提供参考，并为其开发利用提供支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Mettler XS105DU型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；FW100高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；超声清洗机（德国Elma公司）。

1.2 试药与试剂

叶黄素对照品（美国ChromaDex公司，批号：00012453-0646）；β-胡萝卜素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100445-201802）；甲醇，乙腈，二氯甲烷（色谱纯，美国Merck公司）；丙酮，无水乙醇（分析纯，天津科密欧试剂公司）；抗坏血酸（分析纯，天津科密欧试剂公司）；水（一级水，电阻率≥18.2 MΩ·cm）。

1.3 药材

20批蚕沙药材，产地分别为浙江（5批）、四川（8批）、江苏（5批）、广东（2批），经石家庄市食品药品检验中心毕飞霞（副主任药师）鉴定为蚕沙。见表1。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 避光操作。分别精密称取叶黄素对照品19.7 mg、β-胡萝卜素21.6 mg，置同一10 ml棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成叶黄素浓度为1.97 mg/ml、β-胡萝卜素浓度为2.16 mg/ml的混合溶液，作为混合对照品储备溶液。-20 ℃下密封保存。将上述对照品储备溶液稀释10倍，作为混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 避光操作。取CS-8样品，粉碎，过三号筛，混匀，取约0.5 g，精密称定，置25 ml棕色量瓶中，加1 %抗坏血酸水溶液5 ml，加丙酮适量，密塞，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，用丙酮补足至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

全程避光操作。色谱柱：Agilent 5 TC-C18(2)（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇（A）-乙腈（B）-二氯甲烷（C）-水（D）为流动相，梯度洗脱，变换检测波长（442，450 nm），柱温为40 ℃，进样量为10 μl。梯度洗脱程序见表2。叶黄素、β-胡萝卜素混合对照品、蚕沙样品和空白溶液色谱图见图1。

图1 HPLC图谱

表2 梯度洗脱程序

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取2.1.1项下混合对照品储备液，加甲醇适量，分别制成含叶黄素0.0197，0.0985，0.197，0.394，1.97 mg/ml，含β-胡萝卜素0.0216，0.108，0.216，0.432，2.16 mg/ml的混合对照品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，以对照品进样量（mg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：叶黄素：y=792 170x+9859，r=0.9999；β-胡萝卜素：y=281 450x-10.036，r=0.9998。表明叶黄素在0.197～19.7 μg范围内、β胡萝卜素在0.216～21.6 μg范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度考察 取CS-8样品1份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，连续进样6次，分别计算叶黄素、β-胡萝卜素含量的RSD，结果分别为0.5 %，0.6 %，表明本方法精密度良好。

2.3.3 取CS-8样品6份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，计算叶黄素、β-胡萝卜素含量的RSD，结果为0.6 %，0.5 %，表明本方法重复性良好。

2.3.4 稳定性考察 取CS-8样品1份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，分别于0，3，6，9，15，24 h进样测定，记录峰面积值，计算叶黄素、β-胡萝卜素含量的RSD，分别为1.4 %，1.6 %。表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定。

2.3.5 准确度考察 采用加样回收法，取已知含量的蚕沙粉末样品9份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入50 %，100 %，150 %浓度混合对照品溶液，再按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，分别计算叶黄素、β-胡萝卜素的回收率，结果见表3、表4。叶黄素平均回收率为98.79 %，RSD为1.9 %，β-胡萝卜素平均回收率为100.39 %，RSD为1.9 %，表明本方法准确度良好。

表3 叶黄素回收率试验结果

表4 β-胡萝卜素回收率试验结果

3 蚕沙中叶黄素、β-胡萝卜素提取方法研究

3.1 单因素考察

3.1.1 提取溶剂筛选 避光操作。取CS-8样品4份，粉碎（过三号筛），混匀，取约0.5 g，精密称定，分别置25 ml棕色量瓶中，加入1 %抗坏血酸水溶液5 ml，再分别加入甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃适量，摇匀，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，分别用甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃定容至刻度。按2.2项下色谱条件进样测定，分别计算4份样品中叶黄素、β-胡萝卜素的提取率，结果见图2。由图2可知应用丙酮作溶剂，叶黄素、β-胡萝卜素的提取率最高，分别为98.21 %，96.46 %。因此选择丙酮作为提取溶剂。

图2 不同溶剂对蚕沙中叶黄素、β-胡萝卜素提取率的影响

3.1.2 1 %抗坏血酸加入量考察 避光操作。取CS-8样品4份，粉碎（过三号筛），混匀，取约0.5 g，精密称定，每份0.5 g，置于25 ml棕色量瓶中，分别加入1 %抗坏血酸水溶液0，2，5，8 ml，再以丙酮定容至刻度，摇匀，滤过，按2.2项下色谱条件进样测定，计算叶黄素、β-胡萝卜素的提取率，结果见图3。可知1 %抗坏血酸加入量为5 ml时，叶黄素、β-胡萝卜素提取率达最高，分别为98.09 %，96.32 %，因此选择加入1 %抗坏血酸水溶液5 ml。

图3 1 %抗坏血酸溶液加入量对叶黄素、β-胡萝卜素提取率的影响

3.1.3 料液比考察 避光操作，取CS-8样品4份，每份0.5 g，分别置于10，20，25，50 ml棕色量瓶中，所有样品均先加入1 %抗坏血酸的水溶液5 ml，以丙酮为提取溶剂，定容至刻度，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，考察料液比1:20，1:40，1:50，1:100 4种比例对蚕沙中叶黄素、β-胡萝卜素提取率的影响，结果见图4。可知料液比为1:50叶黄素、β-胡萝卜素提取率最大，分别为99.09 %，97.21 %。

图4 不同料液比对叶黄素、β-胡萝卜素提取率的影响

3.1.4 提取温度的考察 避光操作。取CS-8样品，每份0.5 g，分别置25 ml棕色量瓶中，加入1 %抗坏血酸水溶液5 ml，再加入丙酮至刻度，摇匀，分别在20，30，40，50 ℃超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，按2.2项下色谱条件进样测定，计算叶黄素、β-胡萝卜素提取率，结果见图5。由图5可知，随温度升高，叶黄素、β-胡萝卜素提取率升高，40 ℃时达最大，分别为98.18 %，95.07 %。

图5 不同提取温度对叶黄素、β-胡萝卜素提取率的影响

3.2 正交试验

参考单因素试验结果，取CS-8样品，以料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）为考察因素，以叶黄素、β-胡萝卜素提取率为指标，设计L9（34）正交表，以优化蚕沙中叶黄素、β-胡萝卜素的提取方式。因素与水平见表5，正交试验设计与结果见表6。

表5 因素与水平

表6 正交试验设计与结果

通过比较极差（R）值大小，得出各因素影响大小顺序为：A＞B＞C，即料液比影响最大，提取温度次之，提取时间影响最小，分别以叶黄素含量、β-胡萝卜素含量为变量，对正交结果进行方差分析，结果见表7、表8。

表7 方差分析结果（以叶黄素提取率为变量）

表8 方差分析结果（以β-胡萝卜素提取率为变量）

由表7、表8可知，料液比对叶黄素、β-胡萝卜素的含量影响显著（P＜0.05），而提取温度和提取时间对二者含量影响不显著（P＞0.05）。依据表6，综合分析，选定最优化的提取条件为A2B2C3，即料液比为1:50（g/ml），提取温度为40 ℃，超声时间为30 min。

3.3 20批蚕沙样品叶黄素、β-胡萝卜素含量测定

取不同产地采集的蚕沙样品20批，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件测定含量，结果见表9。各批次叶黄素和β-胡萝卜素含量差异较大，20批蚕沙叶黄素含量在0.12 %～0.95 %之间，β-胡萝卜素含量在0.04 %～0.37 %之间。含量高的外观相对偏草绿色，含量低的外观偏灰黑色。分析原因可能与产地、采收时间不同有关。

表9 蚕沙含量测定结果

4 讨论

4.1 色谱条件的选择

取叶黄素、β-胡萝卜素对照品溶液，用DAD检测器在200～500 nm进行扫描。结果表明叶黄素在442 nm、β-胡萝卜素在450 nm处有最大吸收。流动相考察了甲醇-水系统、甲醇-二氯甲烷系统、甲醇-乙腈-二氯甲烷系统、甲醇-乙腈-二氯甲烷-水系统，发现甲醇-乙腈-二氯甲烷-水系统梯度洗脱可较好地分离叶黄素和β-胡萝卜素成分，因此采用四相混合梯度洗脱，结合波长切换，建立了同时测定蚕沙中叶黄素、β-胡萝卜素含量的HPLC色谱条件。

4.2 样品处理方法

由于叶黄素和β-胡萝卜素对光、对热不稳定，因此试验需全程避光，溶液配制用棕色量瓶，对照溶液需冷冻保存，样品提取过程中，不可加热回流，故采用超声提取方法。

5 结论

建立了HPLC同时测定蚕沙中叶黄素、β-胡萝卜素含量的方法，叶黄素、β-胡萝卜素分别在0.197～19.7 μg、0.216～21.6 μg范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）＞0.9990，平均回收率分别为96.84 %～101.71 %、98.01 %～103.29 %。优化了叶黄素、β-胡萝卜素的提取条件，考察了提取溶剂、1 %抗坏血酸溶液加入量、料液比、提取温度对提取率的影响。最佳提取条件为：丙酮为溶剂，料液比1:50（g/ml），40 ℃下超声提取时间30 min。该方法专属性好，准确度高，精密度好，优化的提取条件稳定、可行，可为蚕沙的质量控制及有效成分提取提供参考。