基于近红外光谱反射技术的砀山酥梨花粉活力快速检测

徐叶挺，张校立，庄红梅，董文轩，龚 鹏

(1.新疆农业科学院园艺作物研究所/农业部新疆地区果树科学观测实验站，乌鲁木齐 830091；2.沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110866)

0 引 言

【研究意义】花粉是有花植物雄蕊中的雄性生殖细胞，高等植物的雄配子体[1]。花粉是高等植物的雄配子体，在育种上可用来解决不同果树品种开花期不遇和异地果树品种杂交困难问题。人工辅助授粉或杂交授粉，需要早期采集和贮存花粉，尤其是杂交育种[4]，花粉生活力是花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力[5]。【前人研究进展】检测花粉活力的方法有染色法、萌发法、授粉结实检测法及其他一些方法，常用的染色法有联苯胺染色法[6]、TTC染色法[7]、I2-KI染色法[8]、FCR染色法[9]等，萌发法又包括离体萌发法[10]和活体萌发法[11]。目前这些花粉活力的测定方法中，染色法测定值不是偏高就是偏低[6]。离体萌发法测定值准确可靠，但步骤多影响因素多难掌握[11]。活体萌发测定法，仅适合于感受性柱头，测定值偏低，柱头表面性质对所测试样也有所限制[11]。花粉授粉结实检测法，时间周期长，费时费力，且花粉粒较小，人工授粉时不能定量只能定性[12]。近红外检测技术是一种具有方便、快速、高效、准确、不破坏样品、不消耗化学试剂、不污染环境的检测技术。近红外光谱法(NIRS)利用有机物中含有C-H、O-H、N-H 和S-H等化学键的合频或倍频振动，以漫反射方式获得在近红外区的吸收光谱，通过主要成分分析、偏最小二乘法等现代化学计量学的手段，建立物质光谱与待测成分含量间的多元线性回归方程，实现利用近红外光谱信息对待测成分含量的快速预测。近红外光谱用于烟草[13-14]、茶叶的分类[15]与咖啡碱[16]，光导纤维探头的出现，近红外检测技术可直接用于粮食或水果传送带上进行产品分拣[17-20]。近红外检测技术不仅作为常规方法用于食品的品质分析[21, 22]，而且已用于食品加工过程中组成变化的监控和动力学行为的研究[23]，如近红外光谱技术在水产品检测中的应用[24]；通过测定颜色变化来确定农产品的新鲜度、成熟度，了解食品的安全性[25, 26]；检测苹果、葡萄、梨果汁加工过程中可溶性和总固形物的含量变化[26-28]；通过可见-近红外光谱技术(LS-SVM)判定蜂花粉的贮存时间[29]。【本研究切入点】目前虽然我国近红外检测技术的研究在某些方面较多，但在花粉活力上检测还未应用。亟需基于近红外光谱反射技术的砀山酥梨花粉活力快速检测研究。【拟解决的关键问题】采用近红外检检测方法对砀山酥梨花粉活力进行检测，得到快速检测花粉活力的方法，分析研究基于近红外光谱反射法快速检测砀山酥梨花粉活力的可行性，为工业化生产花粉提供快速检测依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

以2017年3月安徽砀山县果红丰花粉有限公司当年生产砀山酥梨花粉(花粉生产提纯后即干燥低温-20℃下贮藏，花粉活力下降速度较缓)为研究对象。将200 g花粉混合后封装在20个纸质包装中，放在4℃下贮藏(花粉活力下降速度相对较快)。以花粉从-20℃转入-4℃储藏的日期为活力下降的起点，即6月7日(0 d)、6月14日(7 d)、7月4日(27 d)、7月20日(43 d)与8月11日(65 d)。将20个花粉样品取出室温苏醒6 h后，进行近红外光谱扫描及花粉活力测定。测定完成后继续放入4℃下贮藏。

1.2 方 法

1.2.1 近红外光谱扫描

用丹麦FOSS公司生产的NIRSystems Lab 5000型近红外分析仪进行样品的光谱采集。具体方法参照徐叶挺[30]利用近红外光谱采集花粉光谱方法。

1.2.2 花粉活力

参照徐叶挺[30]测定扁桃花粉活力方法。

不同活力花粉中含H键有机物含量变化是影响光谱变化的主要原因。采用多元线性回归、主成分回归和偏最小二乘法等定量校正方法来建立不同花粉活力的定性定量模型。在建立光谱模型时，采用全局中心马氏距离(globalhood，GH)和“T”检验进行两轮异常值的剔除，其中中心马氏距离GH≥10剔除光谱异常值，T检验>2.5剔除化学异常值。经过对的100个不同活力花粉光谱图异常值剔除后，剩余99个光谱数据进行定标模型的建立。

近红外定标模型优劣的参数：决定系数(R2)、定标标准差(SCE)、交互验证标准差(SECV)、交互验证相关系数(1-VR)等。使用不同光谱预处理方法可得到不同的近红外模型，以最高的交互验证相关系数(1-VR)和最低的交互验证标准差(SECV)为标准，来确定并选择最佳定标模型。并利用AACC39-00对近红外预测模型进行判定，即验证相对分析误差RPDCV(RPDCV=SD/SECV)。当验证相对分析误差RPDCV≥3.0，则定标方程预测效果极准确；当RPDCV≥2.5时，该定标方程可用于日常分析检测。当RPDCV在2.0～2.5，则预测方程可接受，但预测准确度不佳。当在2.0以下，方程预测准确度较差。

以花粉活力与波段光谱反射率的相关性分析结果为依据，选取相关性最强的3个波段进行组合，即R1540+R1956、R1540+R2438、R1956+R2438、R1540+R1956+R2438等4种方式，将不同花粉活力对应的反射率进行算术相加、算术相加后取对数、各自取对数后相加3种数学处理，所得的数据作为自变量，以花粉活力为因变量，建立Asymptotic1、SRichards1、ExpAssoc模型。

1.3 数据处理

采用Statistica5.0对梨花粉不同时间测定的活力值进行方差分析。通过WinISIⅢ近红外定标软件，利用花粉活力值及近红外光谱图进行定标模型的建立，根据定标模型参数判断该模型的准确度。不同花粉活力与光谱反射率的相关性分析、作图与模型拟合采用Origin2016完成。

2 结果与分析

2.1 砀山酥梨花粉活力定标集的活力差异

研究表明，在4℃贮藏下，随着贮藏期的延长，花粉活力呈下降趋势。梨花粉在以6月7日为起点(0 d、20份测定值)、6月14日(7 d、20份测定值)、7月4日(27 d、20份测定值)、7月20日(43 d、20份测定值)与8月11日(65 d、20份测定值)。其平均花粉活力分别为70.6%、60.3%、57.1%、53.2%与34.1%，标准差分别为±3.89%、±4.24%、±6.43%、±6.99%与±8.40%。从开始贮藏活力的70.6%降到34.1%，与开始储藏时相比活力下降了52%，且不同贮藏时间下的花粉活力相互差异均显著。100份梨花粉活力测定值定标集。图1

注：不同字母表示LSD测验下在P<0.05水平下差异显著

2.2 砀山酥梨花粉活力近红外光谱预处理

研究表明，不同花粉活力的近红外光谱图在光谱形状也存在差异，有Y轴漂移较大，吸收峰叠加严重现象。光谱吸收峰得到增强，光谱差异更加显著，校正了Y轴基线漂移现象。经导数处理与去散射方法结合处理光谱后，消除了光谱去散射的影响，使不同花粉活力的光谱平行移动得到改善。近红外光谱是由分子振动从基态向高能级跃迁时产生的，主要反映的是含氢基团X-H(如C-H、O-H、N-H、S-H等)振动合频的和倍频吸收。近红外光谱的合频吸收位于2 000～2 500 nm，一级倍频位于1 400～1 800 nm，二级倍频位于900～1 200 nm，三级和四级或更高级倍频则位于700～900 nm。在1 410～1 450 nm处C-H(CH3、CH2)是组合频2ν+δ，1 920～1 980 nm处C=O、3ν倍频，1 940～1 960 nm处游离的-OH组合频ν+2δ和3δ，C-H、CH3、CH2组合频ν+δ。图2

注：SNVD既标准正态变量校正结合去除趋势，图2-a花粉近红外反射原始光谱图；2-b 导数处理1，4，4，1结合SNVD下的光谱图

2.3 砀山酥梨花粉活力近红外定标模型的建立与验证

研究表明，近红外预测模型较优，其交互验证标准差SECV值为2.630，交互验证相关系数1-VR值为0.953，RPDCV值为4.632>3.0，定标预测效果验证准确，可进行日常检测分析。表1

表1 不同光谱预处理下的梨花粉活力定标模型参数

2.4 砀山酥梨花粉活力与不同波段光谱反射率的相关性

研究表明，梨花粉活力与其光谱反射率在近红外光波段均呈正相关性，在1 950～1 960 nm下相关性为0.813，1 520～1 566 nm下相关性为0.790～0.793，2 432～2 444 nm下相关性为0.768。在多个不同的波段都有相关性均大于0.6，即不同波长下对应的含氢集团发生了变化，这些变化与花粉活力发生变化呈相关。花粉活力改变的实质是花粉本身发生了特定的生理生化的变化，这些变化对应的含氢集团发生变化，被近红外光谱仪捕捉后反映在不同波长下的反射率中。图3

图3 不同波长下近红外光谱反射率与花粉活力的相关性

2.5 砀山酥梨梨花粉活力的估算模型

研究表明，拟合后R2均能达到0.946 8以上，其中以算术相加后取对数作为lg(R1540+R1956)自变量，ExpAssoc模型拟合度达0.999 8，拟合效果较好。表2

表2 梨不同花粉活力与光谱变量的函数关系

3 讨 论

花粉在贮藏期间持续不断进行呼吸等新陈代谢活动，同时消耗有机酸和可溶性糖等营养物质，花粉中所含有的蛋白质、酶、核酸及其它的物质在储藏的过程中极易变性，导致花粉的生活力下降直至丧失[1]。花粉活力可以通过花粉中过氧化物酶的活性，呼吸代谢中的还原酶，花粉粒内的淀粉着色，花粉体内的酯酶作用能产生荧光的极性物质荧光素，脱氢酶的活性，花粉管长度来判断花粉的生活力。这些方法是利用花粉体内的酶，或者代谢物质，或者是花粉本身所含有的基础物质[9]。利用花粉呼吸作用或者电导率测定[6]，依据胞质是否具有酶活性进行的染色测定[7]，花粉离体萌发测定[10]，形成有效种子能力的测定。这些花粉活力测定的实质可能是花粉在呼吸作用或者其它的生命活动中，进行能量的传递与转化，其保持活力的物质在低温下可以缓慢的降解或者转化。生命势能在贮藏时间的加长而出现损耗。作为一个带有遗传物质的单元，自我启动的能力降低以至于不能萌发而死亡。通过研究利用近红外测定花粉活力，对花粉代谢作用进行全方位的扫描测定，所得的结果比起花粉活力单一途径及过程中物质测定的准确率高。从开始贮藏活力蛋白质的42.21 mg/g增加到44.64 mg/g，蛋白质增加2.43 mg/g，增加5.8%。花粉活力与脂肪r为0.623，花粉活力与硫甙r为0.813；花粉活力与含水量r为-0.886，花粉活力与蛋白质r为-0.807。砀山梨花粉活力与脂肪、硫甙、含水量与蛋白质之间均有相互关系。

物质的近红外光谱由物质的组成和结构决定。其组成和结构与近红外光谱之间有一定的函数关系[20]。现在，近红外光谱技术(NIRS)已经在食品、药品、化学品等多个领域得到了广泛的应用[24]。近红外检测技术在动植物内含物上的应用。烟叶中27种包括钙、镁元素化学成分[14]。卷烟中的焦油、烟碱和一氧化碳释放量[13]。紫花苜蓿的粗蛋白和粗纤维。奶牛精料补充料中的化学成分及可消化总养分[22]。山药中多糖。高粱中的总酚、缩合类单宁以及3-脱氧花青素含量。葡萄糊状物中麦角固醇含量。果蔬基质中果胶的甲酯化程度[25]。大豆样品水分、灰分、蛋白质以及脂肪含量[21]。研究对花粉活力的近红外测定其实质也是对花粉活力的组成与结构进行分析得到定量的结果。其花粉活力定标模型相关系数R2为0.985，交互验证相关系数1-VR为0.952 9，其活力测定的交互验证标准差SECV为2.5%。利用近红外反射技术快速测定花粉活力可行。

砀山梨花粉颗粒的个头均较小，通常一个梨花粉有43.61～47.85 μm。在使用离体萌发法时，在显微镜下观察到的花粉只是花粉群体当中的一小部分。进行显微镜下观察花粉活力时，由于不同花粉活力在蛋白、脂肪、硫甙等内含营养物质含量不相同[30]，需要多次重复的均值才能表示花粉活力的生理现象[30]。对于研究中每个贮藏时间后的花粉活力，均是由多个数据的平均来代表。由于实验中使用的近红外光谱仪是样品杯是圆形的，充填着大量的花粉粒。近红外光谱扫出不同花粉活力时的近红外谱线，扫描近红外谱线代表的是这次花粉的整体活力。研究使用的花粉活力的均值代表不同贮藏时间的花粉活力。拟合的砀山梨花粉活力与近红外光谱有函数关系，方程R2为0.985，1-VR为0.952 9，其活力测定误差SECV为±2.5%。

4 结 论

4.1采用近红外光谱快速预测砀山酥梨花粉活力，其定标模型相关系数R2为0.985，交互验证相关系数1-VR为0.952 9，其活力测定的交互验证标准差SECV为2.5%。利用近红外反射技术快速测定花粉活力可行。

4.2砀山酥梨花粉活力与其光谱反射率在近红外光波段均呈正相关性，在1 950～1 960 nm下相关性为0.813，1 520～1 566 nm下相关性为0.790～0.793，2 432～2 444 nm下相关性为0.768。通过3种数学处理后的变量拟合的Asymptotic1、SRichards1、ExpAssoc模型，拟合后R2均能达到0.946 8以上，其中以算术相加后取对数作为lg(R1540+R1956)自变量，ExpAssoc模型拟合度达0.999 8。3个波段组合的4种方式以SRichards1模型拟合效果均较好，拟合方程的R2均大于0.992 1。