不同类型稻田亚硝酸型CH4厌氧氧化潜力的比较研究

薛梦琪 周聪 饶旭东 谢晴 张耀鸿

0 引言

滨海湿地处于海陆交错带,具有海洋性和陆地性双重特征,当前受人类活动的影响日益严重．随着经济的发展和人口的增长,人类对土地的需求日趋迫切,滨海滩涂围垦造田成为解决土地问题的有效途径．围垦后的湿地自然条件相对稳定，不再受海水潮汐的影响,形成与自然滩涂湿地明显不同的独特生境．在此基础上,人工灌溉、耕作、施肥、水稻种植等农业措施加速了围垦稻田的熟土化进程，即由海洋性滩涂逐渐向陆地性农田演替,土壤的物理、化学和生物特征发生了显著改变,但与内陆性稻田存在着明显差别．这种围垦植稻驱动的熟土化作用对土壤甲烷氧化过程可能会产生重要影响．那么,处于熟土化进程中的围垦稻田,其甲烷厌氧氧化潜力有何特征?与典型内陆性稻田相比,其甲烷厌氧氧化速率变化的主控因素是什么?是否与功能微生物群落结构及数量特征之间存在内在关系?

鉴于此,本试验选取两个不同类型的稻田:微碱性N贫瘠的长江口崇明围垦稻田和微酸性N丰富的南京稻田,研究其表层和深层土壤的CH4厌氧氧化速率及nDAMO细菌的丰度,探明在土壤母质、pH值、N水平以及盐分等差异较大的稻田土壤环境中,n-DAMO反应速率及其微生物学机理,进一步阐明其分异规律,为稻田CH4减排提供参考依据．

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

本研究选取上海市崇明岛东滩湿地(121.92°E,31.50°N)围垦16年稻田(WK)与南京信息工程大学农业气象试验站(118.86°E,32.16°N)荒地改种稻15年稻田(NJ)．在每个稻田内以S形设置6个采样点,各采样点间距15 m．用土钻取0～60 cm深度的土柱,取出0～10 cm和50～60 cm的土层样品,并将相同深度的土样充分混合,放入冰盒中带回实验室冷冻保存备用．

1.2 土壤理化性质测定

土壤全氮(TN)含量采用半微量凯氏定量法测定．土壤总有机碳(TOC)含量采用浓硫酸-重铬酸钾消煮-硫酸亚铁滴定法测定．土壤铵态氮和硝态氮含量用2 mol/L KCl 溶液浸提后,采用AA3 流动分析仪测定．土壤pH 值和EC值分别采用数字酸度计和电导仪测定．

1.3 厌氧CH4氧化速率测定

培养结束后,用气相色谱仪-质谱仪连用法测定瓶中13CO2的产生量．处理1)为对照组,如果瓶中13CO2的相对丰度处于自然丰度水平(1.1%),说明试验结果可信度高;用处理3)减去处理2)中13CO2产生量,进一步计算亚硝酸型厌氧甲烷氧化(n-DAMO)速率．

1.4 荧光定量PCR分析

用Fast DNA Spin Kit for Soil提取试剂盒 (MP Biomedicals,USA)提取土壤样品中的总DNA．取部分DNA提取液用分光光度计(NanoDrop ND-1000 UV-Vis)测定DNA浓度和纯度．土壤DNA保存于-80 ℃ 冰箱待用．

在CFX96 Real-Time PCR System(Bio-Rad 公司)扩增仪上进行荧光定量PCR扩增．测定土壤样品中总细菌和M.oxyfera菌的16S rRNA基因拷贝数．总细菌基因扩增所用引物为细菌V4+V5高变区通用引物515F/907R;M.oxyfera菌扩增所用引物为qP1F/qP1R．反应体系为20.0 μL,包括DNA样品1.0 μL,Premix TaqTM10 μL,前后引物各1.0 μL,超纯无菌水7.0 μL．扩增条件为:预变性95 ℃,10 min;变性95 ℃,30 s;退火55 ℃,30 s;延伸72 ℃,30 s;40个循环．根据质粒梯度浓度制成的标准曲线计算目的基因的拷贝数．

1.5 数据统计与分析

用SPSS 19.0软件进行统计分析,通过单因素方差分析及多重比较、相关性分析(Pearson)进行土壤理化性质、氧化速率、微生物丰度的差异性以及相关性检验,显著水平α=0.05．

2 结果与分析

2.1 不同类型稻田土壤的理化性质

表1 不同类型稻田土壤的理化性质Table 1 Physicochemical properties of different paddy soils

2.2 稻田土壤的13CO2丰度变化和CH4厌氧速率

图1 南京稻田和围垦稻田土壤厌氧培养后的13CO2丰度变化Fig.1 13CO2 abundance in soils of Nanjing paddy and the reclaimed paddy

图2 不同类型稻田土壤的亚硝酸盐型厌氧CH4氧化速率Fig.2 Potential n-DAMO rate of different paddy soils

2.3 稻田土壤中M.oxyfera菌和总细菌的16S rRNA基因丰度

图3 南京稻田和围垦稻田中M.oxyfera菌和总细菌的16S rRNA基因拷贝数Fig.3 16S rRNA gene abundance of M.oxyfera-like bacteria and total bacteria in Nanjing paddy soil and the reclaimed paddy soil

对稻田土壤总细菌的16S rRNA基因拷贝数进行了测定．其变化范围为(2.12～3.13)×108copies·g-1,比M.oxyfera细菌的16S rRNA基因拷贝数高出1个数量级．其中,南京稻田耕层土壤的总细菌16S rRNA基因拷贝数显著高于其他三个土样．将M.oxyfera细菌与总细菌的16S rRNA基因拷贝数相比,可得出M.oxyfera细菌的相对丰度，发现南京稻田耕层和深层土壤M.oxyfera细菌相对丰度分别为1.5%和0.9%,围垦稻田则分别为0.9%和0.4%．

2.4 厌氧CH4氧化速率与基因丰度和理化性质的相关性分析

对厌氧CH4氧化速率与M.oxyfera细菌的16S rRNA基因拷贝数进行相关分析,结果表明,亚硝酸型厌氧CH4氧化速率与M.oxyfera细菌的16S rRNA基因丰度呈显著正相关(图4),说明功能微生物的数量很大程度上决定了土壤CH4厌氧氧化能力．

图4 厌氧CH4氧化速率与功能微生物丰度的关系Fig.4 Relationship between n-DAMO rate and 16S rRNA gene abundance of M.oxyfera

表2 厌氧CH4氧化速率与土壤理化性质的回归方程Table 2 Regression relationship between n-DAMO rate (y)and soil characteristics (x)

3 讨论

本试验采用13CH4同位素标记法证实了在滨海围垦稻田和内陆南京稻田均发生了亚硝酸盐型厌氧CH4氧化作用．本研究使用的13CH4的丰度为99%,而且起始质量分数高达10%,这样可以最大程度地降低厌氧培养过程中CH4产生过程对试验结果的影响,具有较高的可信度．而且,本厌氧培养试验设置了只加Ar的对照处理,既可测试试验过程是否保持严格厌氧状态,又可测定厌氧过程CH4产生过程特征．结果显示,所试两个土样在培养过程中CH4产生量极低,可以忽略不计．因此,本研究采用13CH4同位素标记法测出的n-DAMO速率能客观真实地反映出土壤的厌氧CH4氧化潜势．其中,围垦稻田土壤的n-DAMO 速率高于杭州湾滨海自然湿地的氧化速率(0.2～1.3 nmol ·g-1·d-1)[14],表明围垦植稻熟土化过程会促进亚硝酸盐型厌氧CH4氧化作用．南京稻田土壤的n-DAMO速率与内陆淡水湿地的氧化速率基本一致(1.8～3.6 nmol·g-1·d-1)[7],表明内陆稻田与淡水湿地均表现出较高的n-DAMO速率．

本试验中,围垦稻田土壤M.oxyfera-like细菌的16S rRNA基因拷贝数为(0.89～2.12)×107copies·g-1,其变化范围与杭州湾滨海和长江口滩涂湿地的数量级一致[10,14],且显著低于南京稻田．不仅如此,M.oxyfera-like细菌的相对丰度也表现为围垦稻田明显低于南京稻田．相关性分析发现,M.oxyfera-like细菌的基因拷贝数与n-DAMO速率、土壤总氮和矿质态氮均呈显著正相关,说明M.oxyfera-like细菌的数量及其活性等生物学特性是导致n-DAMO速率产生空间变异的主控因素．然而,有报道发现,内陆湖泊沉积物中,M.oxyfera-like细菌的基因拷贝数与土壤TOC、总氮和矿质态氮均呈显著负相关,暗示除了土壤理化性质之外,可能还受到其他因素的重要影响,如厌氧氨氧化菌的竞争性生长等．说明M.oxyfera-like细菌在不同类型土壤中分布规律不尽相同,受控因素较多,有待深入研究．

需要指出的是,稻田土壤CH4转化过程及功能微生物群落结构会受到诸多因素的影响,如水稻生育期、施肥量、农田管理等．本研究选取了两种不同类型的典型稻田进行比较,仅能代表所试稻田土壤的厌氧CH4氧化潜势．在此基础上,需要从不同气候带采集更多不同类型的稻田土壤,深入研究典型稻田厌氧CH4氧化作用的本质特征,为探索我国稻田温室气体减排措施提供科学依据．

4 结论

1)内陆性稻田土壤厌氧CH4氧化速率显著高于滨海围垦稻田,其土壤C、N水平和功能微生物丰度是造成两种类型稻田产生差异的主要原因．

2)两种类型稻田中,耕层土壤的厌氧CH4氧化速率显著高于深层土壤,其耕层土壤中功能微生物丰度高、活性氮丰富是CH4氧化潜力较高的重要原因．