多模态超声在类风湿关节炎动物模型中的应用进展

赵海玥,王雅晳,施依璐,段莎莎,赵捷,张璐,白天昊,张小杉

(1.内蒙古医科大学,呼和浩特 010110;2.内蒙古医科大学附属医院超声科,呼和浩特 010050)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病,以侵蚀关节为主要临床表现,可伴有关节外表现,病因尚不明确。在炎性细胞因子及新生血管共同作用下,滑膜水肿增厚,血管翳形成,进而引起骨质破坏,关节畸形,患者生活质量下降[1]。因此,尽早检出滑膜血管翳是改善RA 预后的关键[2]。随着超声探头工艺和图像处理技术的进步,促进了诊断技术的不断发展及诊断模式的多样化。RA 动物模型能很好地再现疾病发生发展的病理生理过程,可供研究人员寻求潜在的治疗靶点,为临床治疗RA 奠定基础[3]。目前,RA 动物实验中常用的超声技术包括灰阶超声、多普勒超声、超声造影、超声生物显微镜、超声引导穿刺活检和关节腔注射及超声靶向破坏技术。上述多种超声技术协同作用互为补充,形成了综合性无创的多模态超声。它是在常规二维超声基础上发展起来的多功能超声检测手段,弥补了单一超声成像模式的不足,为疾病诊断提供更可靠的依据[4]。本文拟对多模态超声在RA 动物模型诊疗中的应用进行综述,为RA 动物实验研究提供影像学评估方法。

1 RA 动物模型

RA 动物模型主要有啮齿类大小鼠、兔类、非人灵长类等。啮齿类动物模型因遗传背景稳定、成本低、易于处理而被广泛应用[5-6]。RA 模型的制备方法主要有诱导型,转基因型两类[7]:(1)诱导型关节炎包括胶原诱导型关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)、佐剂诱导型关节炎(adjuvant-induced arthritis,AIA)、链球菌细胞壁诱导型关节炎等[6]。CIA 的病理学及免疫学发展过程与人RA 相似度高,适用于机制探索,药物开发等多方面研究[8];AIA 病理表现与人RA 相似,价格便宜、制作方便、容易成模,但病变具有一定自限性[9],故对同一实验组前后对照研究评估药物疗效时需将此因素考虑在内;链球菌细胞壁诱导型关节炎在观察急性反应方面具有优势,但成本较高,且不能在非人灵长类动物中被诱导,应用受限[10]。(2)转基因型RA模型主要有K/BxN 转基因型、人肿瘤坏死因子(TNF)转基因型和白介素-1 缺陷型(IL-1α-/-)等,是研究RA 发病机制和分子靶向制剂较好的模型。K/BxN 转基因型小鼠模型发展迅速,可在多种小鼠品系中复制,适合筛选抗关节炎药物及治疗新靶点;TNF 转基因型小鼠表型稳定,进展相对缓慢,适合TNF-α 等抗体的靶向治疗及相关免疫机制的研究;IL-1α-/-转基因型小鼠主要用于全基因组微阵列分析,研究IL-1β 在类风湿疾病中的作用[5-6]。不同的模型,其发病机制不同,应根据实际要解决的科学问题选择合适的模型。

2 多模态超声在RA 动物模型诊断中的应用

2.1 高频超声

RA 模型在炎性早期表现为皮温升高、关节肿胀、活动受限等。其主要病理生理学改变为关节内滑膜因炎症细胞浸润而出现水肿增厚,在炎性因子及滑膜新生血管共同作用下,形成滑膜血管翳,血管翳侵入关节周围骨组织,导致骨表面连续性中断、缺损及骨质破坏[11]。高频超声(常用频率为15～20 MHz)能实时动态监测病变发展进程。

超声波的发射和接收都是通过超声探头来实现的。灰阶超声利用脉冲-回波的原理,以脉冲波的形式进入人体,在声束路径上遇见不同声阻抗的两个界面会产生反射或散射现象,这样就有部分超声能量返回探头并被接收处理,这部分信号即为回波信号。回波信号由探头转换为电信号后被超声仪进行放大、后处理形成不同灰度等级的图像,即灰阶超声图像。通过分析图像可以获得组织结构与病变信息,因此,灰阶超声可清晰分辨RA 关节滑膜组织,关节腔积液及骨组织,显示RA 关节病变的形态学变化。滑膜炎症表现为关节腔内增厚的低回声区,形态不规则,探头加压不变形;关节腔积液表现为不规则的无回声区;骨质破坏表现为骨皮质回声粗糙,连续性中断[12]。于静等[13]研究显示高频超声诊断滑膜增生和关节腔积液较为准确,与MRI诊断结果符合,具有省时、经济成本低等优势,但对软骨及骨的观察尚不满意。马茹等[14]研究表明高频超声适用于RA 模型滑膜炎的评估,敏感性优于足趾厚度检测及关节炎评分。灰阶超声可对RA 模型关节病变严重程度进行定量评估,为RA 诊断及预后评价提供影像学支持。

多普勒超声可评估滑膜血流,在评估小动物关节疾病中具有重要应用价值[14]。用于RA 模型的多普勒超声检查技术包括彩色多普勒血流成像(color doppler flow imaging,CDFI)和能量多普勒成像(power doppler imaging,PDI)。CDFI 利用多普勒频移原理,基于运动目标显示器、自相关技术、彩色数字扫描转换和彩色编码等过程实现血流的彩色成像,并根据红细胞的移动方向、速度及分散情况,调配红、绿、蓝三基色,改变其亮度,叠加在灰阶图像上显示。红色表示血流朝向探头方向,蓝色表示血流背离探头方向,绿色、五彩镶嵌表示湍流。颜色亮度与血流速度呈正比,故CDFI 可以反映血流速度和方向的变化,但受检测灵敏度及角度依赖性的影响,检测结果通常会存在较大差异。PDI 提取和显示能量信号强度,其频移能量强度取决于取样中红细胞相对数量的多少,故PDI 能够显示较完整的血管网,特别是对小血管和低速血流更易显示,且不受角度依赖性的影响,可敏感地反映滑膜内新生血管,在评估RA 滑膜炎活动性方面应用较多[15-17]。Liu 等[18]在研究中指出PDI 可对滑膜血流进行分级,并量化分析了滑膜新生血管随时间的变化过程,表明PDI 是监测滑膜血管变化的敏感指标,但PDI 只能检测到直径大于100 μm 血管内的血流信号,对微小血管内血流信号的检出效果并不理想。

此外,灰阶超声和多普勒超声可分别对滑膜增生、滑膜血供及骨破坏进行评分,即目前临床应用较多的Szkudlarek 评分标准[19]。RA 动物实验研究中参考Szkudlarek 评分对滑膜血流进行分级:0 分,无血流信号;1 分,少许点状血流信号;2 分,多发点状及条状血流信号,充盈面积小于滑膜总面积的一半;3 分,树枝状、网状血流信号,走形迂曲,出现融合血流,充盈面积大于滑膜总面积的一半。虽然滑膜血供分级被广泛借鉴于RA 动物研究中[18,20],但超声对RA 模型骨破坏评估尚未报道,这可能与动物关节小、超声评估困难有关。

2.2 超声造影

超声波遇见小于入射声波的界面会发生散射,散射强弱与散射体大小、形状及周围组织的声阻抗差有关,血液中的有形成分(红细胞、白细胞及血小板等)声阻抗差小,散射很微弱,故超声波通过时,无波反射。超声造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)是指人为的在血液中加入声阻抗值与血液截然不同的介质(微气泡),增强组织血管内的散射回声,提高信噪比,从而更敏感地反映组织微血管的灌注信息[21]。CEUS 常用的造影剂SonoVue,粒径小、分散均匀,稳定性好[22],可以检测直径<50 μm的毛细血管,能够清晰地显示RA 滑膜血流灌注情况,在早期诊断滑膜炎方面具有良好的临床应用价值。Liu 等[20]研究结果指出CEUS 评估RA 滑膜新生血管优于PDI。CEUS 还可通过机器自带的后处理软件,绘制时间-强度曲线,为滑膜灌注提供定量数据[2,15]。滑膜超声造影可根据国际关节炎分级标准[23]进行评估:0 级,滑膜无增强;1 级,滑膜轻度增强,增强强度<周围组织;2 级,滑膜明显增强,增强强度>周围组织。

除广泛用于临床的SonoVue,实验中应用的超声造影剂,还包括各种靶向造影剂,即将抗体、多肽等特异性配体连接到微泡上,利用其与炎症部位相应受体的特异性结合,进行RA 的早期诊断及疗效评估等。Zhao 等[24]将血管内皮生长因子受体2 抗体与荧光染料cy5.5 整合到微泡上,制备多模态靶向造影剂,与炎症病灶中的血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)特异性结合,通过CEUS 及光学成像系统检测,验证了VEGF在AIA 大鼠关节炎组织中呈高表达,在分子层面上揭示靶病变的炎症变化。

2.3 超声生物显微镜

尽管高频超声在评估RA 模型具有可行性,允许在整个实验中对同一动物进行对比分析;但由于RA 模型动物通常体型较小,超声分辨率仍显不足[17]。超声生物显微镜(ultrasound biomicroscope,UBM)由高频换能器和高分辨率超声仪构成,工作原理与灰阶超声相似,利用探头产生40～100 MHz的脉冲,在一定范围内来回作线性扫描,其反向散射返回能量转换为射频信号,信号按照一定比例被放大、加工、时间增益补偿后形成图像在显示屏上呈现,利用图像灰度、明暗度代表不同组织结构。其探头频率高,分辨力好,故适用于浅表组织成像,临床常用于眼科病变的检测[25]。在动物模型中,UBM 最早应用于小鼠心脏观察[26],后续用于CIA大鼠模型及小鼠结肠肿瘤的检测[27]。宋海霞[28]研究显示UBM 可清晰地显示增厚的滑膜、新生血管及关节腔积液等,是RA 实验研究理想的影像学方法。马俊福等[29]用UBM 观察温经通络法对CIA 大鼠疗效的影响,并与病理结果相比较,也证明了UBM 对CIA 大鼠早期诊断、病情监测及疗效观察具有较好的应用价值。

3 多模态超声在RA 动物模型治疗中的应用

3.1 超声引导穿刺活检和关节腔注射

以往实验研究因获取动物病理标本需要处死动物,而造成实验过程中模型需求量较大,超声引导穿刺活检技术可以弥补这一缺陷,实现在活体内连续动态评估RA 病程及干预后疗效,并以病理评分作为金标准,与超声结果进行相关性分析,从而验证超声评估RA 的可行性和有效性[12,18,20,30]。超声引导下关节腔注射给药安全性好,利于药物在局部吸收,减少全身给药所致的副作用。林娇娇等[31]研究表明超声引导下关节腔内注射纳米载药颗粒治疗RA,疗效好且副作用小,在RA 治疗中具有重要价值。超声引导下关节腔注射实现了精准给药,为实验研究及临床治疗提供了优化方案。

3.2 超声靶向治疗

除用于诊断性研究,微泡还可作为治疗剂,在超声介导的治疗中发挥重要作用[32]。超声微泡可作为一种良好的递送载体,保护药物分子或基因在运输过程中免受内源性清除,将其靶向传递到病灶区,借助基于超声空化效应及声孔效应等生物物理学特性的超声靶向破坏技术(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD),使其在靶区受控释放,并增加血管的通透性,促进药物进入组织和细胞,提高靶区的药物吸收和生物利用度,减少全身副作用[33-35]。张烨[36]研究显示于大鼠膝关节腔内注射携氧紫杉醇脂质微泡,经超声辐照关节(强度2 w/cm2,时间30 s),可较好的靶向破坏载药微泡,提高病灶区药物吸收,减轻CIA 大鼠关节炎症。Zhao等[37]研究指出,与静脉注射游离甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)相比,UTMD 介导的MTX 脂质微泡受控释放可精确影响炎性病灶,显著提高RA疗效。Wang 等[38]证实了UTMD 可促进地塞米松磷酸钠靶向脂质体在RA 协同治疗中的可行性和有效性,指出叶酸偶联的地塞米松磷酸钠靶向脂质体局部释放对CIA 大鼠具有良好的治疗效果。动物模型的超声靶向治疗,为临床使用新型靶向载药微泡治疗RA 提供实验依据,使超声靶向治疗有望成为RA 新的治疗方案。

4 结语

灰阶显像及多普勒技术,可定性、定量诊断RA,对病情活动性变化进行实时监测;超声造影在检测RA 早期病变中具有独特的优势;UBM 则可清晰显示RA 模型的关节病变,适合小型动物及浅表疾病的检测;靶向微泡的应用,实现了在分子影像层面对RA 的诊断,为超声分子影像早期精准诊断RA 和药物疗效评估奠定基础。超声引导穿刺实现了对动物实验的连续性观察,减少动物的损耗,更好的模拟RA 病程;UTMD 实现了靶向控释给药,提高局部疗效的同时减少全身副作用,为RA 治疗的机制研究和疗效验证起到推动和促进作用,为临床应用奠定基础。故多模态超声在RA 动物实验中具有便捷、实时监测、准确定性及定量等优势,在RA早期诊断、病情监测及药效评价方面意义重大,是RA 动物实验研究中重要的影像学方法,具有实用价值。