啮齿类动物烟碱依赖相关的行为学评价方法

李凯欣 陈欢刘方邻 刘勇侯宏卫∗胡清源∗

(1.国家烟草质量监督检验中心,烟草生物学效应重点实验室,转化神经生物学联合实验室,郑州 450001;2.中国科学技术大学,合肥 230026;3.中国科学院合肥物质科学研究院,合肥 230031)

药物依赖涉及社会科学、心理学、药理学、精神病学、遗传学、行为学等多个学科[1]。烟碱依赖(nicotine dependence,ND)是药物依赖中影响最广泛的一类,《2020 年中国吸烟危害健康报告》显示,全世界大约有10 亿烟民,2018 年中国15 岁以上吸烟率为26.6%,人数超3 亿[2]。烟气成分非常复杂,已经发现了7000 多种物质,其产生的神经生物效应目前主要利用烟碱或烟气冷凝物等进行动物和细胞实验来揭示[3]。烟草具有双重效应,积极强化作用主要发生在依赖的开始阶段,包括轻度欣快感、记忆力增强和情绪放松,而吸烟的消极影响则由戒断引起,包括情绪低落、焦虑和记忆受损,两者结合最终导致烟草使用和依赖[4]。

建立具有相应表型特征的动物模型是分子机制研究的基础。相较于其他模式生物,啮齿类动物具有体型较小、性情温顺、易于饲养、繁殖周期短等优点,且结构、功能、代谢及依赖特点也与人类高度类似,其中烟碱依赖模型的啮齿类动物以小鼠和大鼠为主。通过模拟烟碱依赖环境构建动物模型,有助于研究脑部组成结构的改变与行为变化的关系和发生机制,包括相关脑区的激活、脑部神经递质水平的变化、脑部高级功能的改变等。本文针对各类行为学测试在ND 研究中的应用及优缺点进行了详细分析,为ND 动物模型的成瘾机制、脑部功能损伤及行为障碍研究提供有益的参考。

1 烟碱依赖行为的神经生物学基础

ND 的形成产生了心理障碍和行为障碍双重影响。而在烟碱成瘾的分子机制的研究中以人为研究对象多有不便,因此动物模型凭借其饲养简单、繁殖速度快与人类同源性高、可训练等优势成为了较好可替代的研究对象,在烟碱依赖的研究中发挥着重要作用。在之前的研究中基于多种ND 动物模型的建立,通过微透析、病毒示踪、光遗传等技术发现烟碱可以引起中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)、前额叶皮层(prefrontal cortex,PFC)、海马(hippocampus,HP)等与学习记忆相关脑区神经递质的变化[5-6]。主要涉及3 大神经系统:多巴胺能系统、5-羟色胺系统、谷氨酸系统,其投射通路如图1 所示[7]。烟碱作用于烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs),引起脑中相关神经递质的变化,激活细胞内信号传导通路,导致神经元的形态结构及脑部高级功能改变,最终导致ND 形成[8]。

图1 3 大神经系统在大脑相关脑区的部分投射Figure 1 Three major nervous systems project to related areas of the brain

1.1 烟碱依赖的奖赏效应

ND 引起的奖赏效应主要由多巴胺能系统中的神经递质DA 介导,其中DA 主要由中脑基底核的黑质(substantia nigra,SN)和VTA 区产生。烟碱摄入后通过引起NAc 区DA 的大量释放使得机体产生愉悦感,是引起依赖性的主要原因[9]。多巴胺引起奖赏效应的通路称为中脑边缘通路(mesolimbic pathway)或奖赏通路(reward way)[10]。此外,从黑质投射到纹状体的黑质-纹状体通路,也与ND 行为有关[11]。因此烟碱导致多巴胺能系统中的DA 释放异常是形成ND 生理上的主要诱因[12]。心理上主要跟强化作用有关,会逐渐增加产生奖励感觉的烟碱剂量,即精神依赖行为,是引发复吸行为的原因[13-14]。大鼠ND 动物模型微透析实验发现,急性给予烟碱注射或慢性长期烟碱暴露均显著增加NAc中DA 释放水平,表明DA 在ND 过程中起到重要作用[15]。烟碱的奖励作用类似于多巴胺受体的激动剂,可以激活D1 受体来促进ND[16]。在啮齿类动物中烟碱引起的奖赏效应主要表现为对烟碱的自主性使用偏好,也是ND 行为的一个核心特征[17-18]。

1.2 烟碱依赖的戒断效应

烟碱戒断后引起的戒断效应主要与5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)神经递质有关,在解剖学上5-羟色胺能神经元起源于脑干中缝核群,通常与情感性疾病、自杀、冲动和药物滥用有关[19]。该系统的神经递质为5-羟色胺,是一种单胺类的抑制性神经递质,其在维持突触的可塑性、增强学习记忆、情绪等方面发挥了重要作用[8]。5-HT 还可以通过调节多巴胺神经元上的5-HT 受体来调节多巴胺释放[20],NAc 的多巴胺神经元上的5-HT1A 受体可以促进DA 释放[21],而其戒断效应的产生主要是纹状体和中脑的多巴胺能神经元上的5-HT2A 和5-HT2C 受体可以抑制DA 释放,从而增加焦虑症状[22-23]。研究表明慢性烟碱暴露可以引起大脑5-HT 水平升高,可能是易成瘾和复吸的另一个风险因素[24],戒断后其水平下降,提高5-HT 水平有助于减弱复吸等ND 行为[8],这也解释了戒烟后会引起焦虑抑郁症状与5-HT 神经元活动下降有关[25]。ND 导致的情绪不稳定、亢奋不安等现象都与5-HT受体在引起情绪行为异常有关[26],该效应在啮齿类动物中主要表现为过度梳理、咀嚼、震颤、湿狗抖动(wet-dog shakes)和牙齿打颤,可通过这些行为特征来评价动物模型产生地戒断行为[27]。

1.3 烟碱依赖行为的形成

烟碱依赖行为的形成还依赖于谷氨酸能系统,其主要参与大脑突触可塑性、认知、学习和记忆以及发育过程[23],其中谷氨酸(glutamic acid,Glu)是最重要的兴奋性神经递质,50%的Glu 参与突触传递,离子型Glu 受体参与学习、记忆、药物依赖及神经退行性疾病等多种病理生理过程[28]。啮齿类动物模型在评价其烟碱成瘾后学习和记忆的能力上也有很好的应用。烟碱进入大脑后可以作用到PFC通过引起Glu 释放兴奋多巴胺神经元,产生奖赏效应[5]。另一方面,烟碱可以作用到兴奋性Glu 神经元,形成长时程增强(long-term potentiation,LTP),大脑由神经元细胞和神经胶质细胞构成并互相连接,烟碱通过谷氨酸能系统增强这些连接,引起大脑的结构的改变。这也是烟碱依赖行为的另一大神经基础。

1.4 烟碱依赖与其他神经递质的关系

烟碱在脑中还与其它神经递质系统有相互作用。研究发现,对啮齿类动物模型给予急性或慢性烟碱处理后,大鼠中脑的去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)释放都会增多[29]。烟碱通过两个途径来调控NE 的分泌,一是直接作用到蓝斑末梢的nAChRs;二是间接作用通过GABA 来调节NE 的分泌[5]。另外,烟碱通过代谢性GABAB 受体(ABABRs)介导缓慢抑制,调节整个大脑的突触可塑性[30]。GABA 受体激动剂会降低烟碱诱导的NE释放增加,阻碍条件位置偏爱(conditioned place preference,CPP)的形成和烟碱的自给药行为[31]。内源性大麻受体也与烟碱的成瘾有关[32]。内源大麻受体拮抗剂会减弱中脑边缘系统多巴胺的活动,从而减弱烟碱奖赏效应[33]。总的来说,多种神经递质均参与调节了ND 行为的形成。

2 烟碱依赖模型行为学评价实验

根据烟碱成瘾的神经生物学基础,大脑结构和功能的异常可以总结为精神依赖性、躯体依赖性以及耐药性3 个特征。精神依赖性主要体现在初始阶段,即动物情绪愉悦、自主活动增加、记忆力增强等促使动物产生心理上渴求。躯体依赖性和耐药性主要表现为动物的精神活动刺激反应增强,停止烟碱暴露会导致烟碱戒断症状,如躯体戒断体征、焦虑和抑郁样行为、学习和记忆缺陷、烦躁不安等。ND 动物模型的行为学测试包括行为偏好、学习与记忆、认知和决策功能、情绪、运动协调能力等5 大方面,通过这些实验有助于建立及评估ND 模型(见图2)。

图2 啮齿类动物烟碱依赖模型行为学评价Figure 2 Behavioral evaluation of nicotine dependence models in rodents

2.1 行为偏好训练实验

行为偏好训练实验主要通过特定的仪器及模拟成瘾过程的训练方式给予动物致瘾性药物或对照物,使动物将致瘾性物质和环境建立联系,最终产生偏好。利用啮齿类动物建立与人类一致的ND行为,从而进一步研究该动物模型的依赖程度及分子机制。行为偏好训练主要分为自身给药模型、自给光模型、条件性位置偏爱模型、行为敏化模型等[34]。啮齿动物对烟碱的依赖可以通过反复注射烟碱、通过渗透微泵长期输注烟碱、口服烟碱、卷烟烟气暴露、烟碱雾化暴露和含烟碱电子烟气溶胶暴露等不同的给药方式来获得。行为偏好训练实验的评价标准主要从可靠性、测试效度、实用性和敏感性4 个方面来进行评估。

2.1.1 自给药实验

自给药实验(self-administration test,SA)是通过操作性条件反射测试箱(operant conditioning test box)对实验动物进行自我给药训练,其最显著的特征是其获取烟碱的方式是完全自主行为(压杆或者鼻触)[35]。大小鼠烟碱的静脉给药浓度范围为0.03～0.1 mL/kg,过低不足以形成药物依赖,过高会导致烟碱厌恶[36]。训练的程序设定有固定比率和累进比率两种,比较动物在每个阶段的压杆或鼻触次数在不同程序中的变化[37],成瘾后的戒断阶段即断点可以评价其成瘾性的高低及动物觅药渴求程度的高低[38]。静脉自给药模型中实验动物能够很好的模拟用药者主动觅药过程和用药行为,可以精准掌握药物的摄入剂量,是研究药物成瘾的经典模型,但缺点是动物手术难度高、操作难度大,失败率较高[39-40]。目前已经开发出了更能模拟烟气吸入方式的烟碱自给药模型,如新型气溶胶吸入式的烟碱自给药模型[41],通过动物自主鼻触释放含有不同浓度烟碱的电子烟气溶胶(20,40,80 mg/mL)[42]。用于评价含烟碱或烟碱盐等不同类型的烟碱产品,气溶胶自给药模型还可用于评价卷烟烟气和电子烟气溶胶中其他复杂的化学成分和添加剂等对烟碱依赖的增强特性,但气溶胶释放稳定性的精准控制和动物实际摄入药物剂量的准确评价仍是技术难点。

自身给药训练能够准确统计用药次数。在结构效度上与人类成瘾机制类似,充分反映了动物的主观要求,可信度高,但是也有局限性,不能很好的反映无药可用时的强烈渴求状态。

2.1.2 条件位置偏爱实验

条件位置偏好实验(conditional position preference,CPP)是根据巴普洛夫条件反射原理建立起来的动物模型,主要通过给予动物奖赏或厌恶刺激或者对照溶剂,使得动物对注射的物和环境之间建立联系。其通常由3 个隔间构成,两个隔间的环境必须具有差异性,在空间配置、颜色、地板甚至其他感觉上都要形成对比,中间的隔间用于适应环境。烟碱训练时选择在白箱注射烟碱,黑箱注射生理盐水,多次操作后可以让动物对环境和烟碱形成条件性匹配[43]。目前已成功建立的烟碱CPP 模型,在0.1～1.4 mg/kg 的剂量范围内均可诱发大鼠CPP[44]。此外利用CPP 训练给予奖励性刺激来研究奖赏系统的相关神经通路也是研究成瘾的重要手段[44]。啮齿类动物可以通过CPP 训练来构建ND 模型后进而评价其对学习记忆的影响[45]以及对性别差异造成的偏好差异进行评价[46-47]。

CPP 动物模型的构建原理依托于低级神经系统支配的低级反射活动,训练更为简易且廉价,实验周期也较短,因此其在成瘾行为模型构建中也有十分广泛的应用,比较适用于数据量较大的实验,且数据较离散。

2.1.3 行为敏化训练

行为敏化训练主要基于“神经激励敏化”理论,即对成瘾药物从“喜欢”到“需要”的心理活动的一种转变[8],行为敏化的建立过程包括3 个阶段,即形成期、转换期和表达激发期。形成期每天对动物进行烟碱注射,持续5～7 d;转换期停止给药,戒断4～7 d,在这一期间动物行为转变为敏化;表达激发期动物接受烟碱注射后可激发动物行为敏化,其自发性活动明显的增加。通过3 个时期的训练,动物从对烟碱的高活动性转变为行为敏化。动物行为敏化训练后会产生运动行为增加等成瘾性运动效应[48],烟碱通过直接或间接方式引起脑内DA 水平升高后,直接表现是动物活动性增加[49]。啮齿类动物通常表现为在相对狭窄的空间内运动行为增加和反复行为的增加(如咀嚼、摇头和挠痒),实验中可以进一步用运动协调能力实验来评价成瘾性高低。

目前成瘾致敏理论已经得到广泛认同,具有良好的理论和结构基础,并且操作简单易行,实验周期较短,评价方法直观,是一种良好的ND 以及抗成瘾药效评价。

2.2 决策与认知实验

长期烟碱暴露会导致大脑结构发生变化,影响与决策有关的神经结构和大脑功能,可以利用风险决策实验来检测动物的决策能力受损程度。啮齿类动物决策和认知评价实验包括大鼠博弈任务(rat gambling task,RGT)、概率折扣任务(probability discounting task,PDT)、延迟奖励任务以及大鼠气球模拟风险决策任务(rat balloon analog risk task,RBART)等[50]。良好决策行为的基础包括了奖赏、情绪、学习记忆、运动执行等多个神经系统[8]。大脑功能损伤可能导致认知障碍、行为异常等现象,“从认知改善到复发预防”已经被作为成瘾障碍辅助治疗的思路[51]。神经递质如DA、5-HT 等也参与调节风险决策及多种认知功能[52]。通过PDT 实验发现研究发现,成瘾会导致眶额皮层和额叶皮质受损,进而影响决策。决策认知测试可以评价大小鼠烟碱偏好训练中的决策行为及认知水平[53],延迟奖励任务中的冲动选择可以预测烟碱戒断后的再次使用情况[54]。

2.3 动物情绪测试实验

由戒烟导致的身体、情感和认知症状组成的戒断综合征,是复吸的危险因素[55]。这些戒断症状在停止烟碱暴露后的第1 周内最为明显,其中焦虑和抑郁样的行为,以及学习和记忆缺陷甚至会持续数月[56]。啮齿类动物的情感症状比躯体症状更微妙,因此评估需要一系列行为分析来揭示与戒断相关的情感变化(单一测试不行)。情绪测试主要包括高架迷宫(elevated plus maze,EPM)、零迷宫(zero maze)或O 型迷宫(O Maze)、蔗糖偏好测试(sucrose preference test,SPT)、悬尾测试(tail suspension test,TST)、强迫游泳测试(forced swim test,FST),颅内自我刺激(intracranial self-stimulation,ICSS)等[57],通过ND 动物的情绪状态可以反映戒断症状的严重程度。EPM 用来测试动物烟碱暴露后的焦虑情况[58],EPM 容易测试和记录,不需要预训练,但依赖于啮齿动物的探索性[59]。小鼠在O 迷宫开放臂探索的时间减少反映了其在摄入烟碱后的焦虑行为[60]。SPT 和FST 用于烟碱戒断期间动物快感缺乏和抑郁的测试[61-62],小鼠在烟碱戒断过程中,蔗糖偏好程度下降[63]。FST 测试表明烟碱戒断模型中其绝望行为增加表现为不运动,为了排除运动性能不足,可以补充耐力游泳测试[62]。快感缺乏是戒断的症状之一,ICSS 可用于评估戒断过程中的快感缺乏[64],也作为评估烟碱暴露和急性、慢性戒断烟碱给药的方法[65]。

2.4 学习记忆能力实验

大脑中α7 和α4β2 的nAChRs 在与学习和记忆至关重要的脑区如海马和大脑皮层中大量表达[66],小鼠接触电子烟气溶胶或戒烟后,其戒断症状如学习和记忆缺陷会从第1 天持续到第90 天[67]。烟碱长期作用于nAChRs 会导致其脱敏,对动物的学习和记忆能力有一定的影响。迷宫类实验是研究啮齿类动物学习、记忆和空间定向以及认知能力常用的实验仪器,主要包括T 迷宫、Y 迷宫、水迷宫、八壁迷宫等类型[68],在评估ND 动物模型的认知下降、海马结构损伤和烟碱对空间记忆的影响时常使用此迷宫进行测试,已发现烟碱暴露模型中雄性小鼠的注意力和工作记忆有显著缺陷[69]。运用八臂迷宫评估发现小鼠烟碱暴露后存在空间记忆和参考记忆缺陷[70]。此外还可以采用不同的学习记忆方式,如改进的高架迷宫测试、情境恐惧条件反射测试、被动回避测试和物体识别测试评价ND 及戒断过程中的学习记忆能力。

2.5 运动协调能力实验

低剂量的烟碱会增加小鼠和大鼠的运动活性并引起运动敏化。通过对啮齿类动物进行感觉测试、运动测试、反射测试和梁平衡测试,来评估其神经缺陷和神经损伤的级别[71]。其评价测试包括:旷场实验(open-field test,OFT)、转棒测试(rotarod test,RRT)、横梁行走、握力测试和网格行走测试(grid walk test,GWT)等。OFT 用来评价实验动物在空阔的环境中的各种行为发生情况[72],通过记录分析发现烟碱戒断后动物存在颤抖、摇晃、跳跃、后退、点头、咀嚼、站立、抓挠、梳理、打转、挖洞、腹部收缩、舔舐等状态的异常[56]。RRT 和横梁行走可以测量运动协调和平衡,用于测试摄入烟碱形成依赖后对运动协调可能产生的副作用,评估其感觉运动神经功能缺损[73]。通过横梁行走测试能够检测ND带来的精细运动缺陷[73]。抓力测试评价了烟碱对动物肢体肌肉的影响,网格行走测试主要可以对运动异常和行为缺陷进行评估[74];这些测试大多数都需要自动化设备和软件来进行视频分析。

2.6 实验数据采集及分析方法

行为学实验需要对指标进行客观判断,观察过程中不能影响动物的正常活动,尽量保证实验结果的正确性。目前对于动物行为学的测试可以借助仪器设备进行数据采集,包括数据信息、视频信息、声音信息等[75](见图3)。图像处理法能够对动物行为进行更灵活、精细、全面的测量,目前已成为最受欢迎的行为识别技术[76]。Peleh 等[77]发明一种跟踪和分析工具,用于小鼠组的行为观察。现已开发了多种软件分析系统及算法设计,基本流程如下图所示,可以在线对运动轨迹、划分区域内啮齿类动物各种行为特征进行分析,生成运动轨迹热图和各类图表,提高动物行为学实验的准确性和实验效率。

图3 实验数据采集及分析流程Figure 3 Experimental data acquisition and analysis process

3 小结

烟碱成瘾机制非常复杂,如何评价动物模型的依赖程度高低及其戒断症状是值得深入探讨的问题。开展ND 的形成、维持和复吸等相关机制研究,首要挑战是开发具有更高更有效性的依赖和戒断的动物模型及行为学评价模型。通过多种暴露方法建立ND 模型及烟碱戒断动物模型,可以从成瘾程度的高低、戒断症状的轻重、药物治疗的效果等多个方面进行评价。

在行为学测试中,除检测方法、技术参数外,还有很多因素会对实验结果产生影响,应得到足够的重视。首先给药方式的选择上应更接近于烟草产品的实际使用情况。其次应不断开发更完善的测试方法及行为学自动化记录分析仪器设备,以减少外界影响,提升数据采集分析的客观性和准确性。另外现有研究大部分只使用成年雄性啮齿类动物来评估烟碱戒断及药物治疗的影响。为了提高各种ND 模型的预测效度,可以开发更有效的动物依赖和戒断模型研究ND 及戒断后的症状。此外探究ND 与性别和年龄的差异将对人类ND 的治疗有更大的意义,可能会促进新的药物疗法的发展,减轻ND 及戒断的症状。将有望全面揭示相关脑区和神经环路,神经递质等分子机制。