斑马鱼模型在新精神活性物质代谢研究中的应用

许琳灏，刘信泽，刘 伟，向 平，杭太俊，阳 硕，严 慧*

（1司法鉴定科学研究院上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台司法部司法鉴定重点实验室，上海 200063；2中国药科大学药学院，南京 210009）

根据联合国毒品和犯罪问题办公室（United Nations Office on Drugs and Crime，UNODC）的权威解读，新型精神活性物质（new psychoactive substances，NPS）一词指的是“不受《1961 年麻醉品单一公约》或《1971 年精神活性物质公约》管制，但具有滥用潜力并会对公众健康带来威胁的物质”。这些物质可以是天然或合成的，其目的是模仿传统滥用药物的已知效果［1］。在这种情况下，“新”一词并不一定意味着新合成的，而只是指最近出现在毒品市场上的，它们的化学或合成过程被稍加修改，以产生与已知非法物质（例如大麻素）类似的效果。这些物质常常被标榜为“法律高点”“浴盐”或“研究化学品”来销售，以规避法律的制裁［2］。根据UNODC 关于NPS 的预警咨询（Early Warning Advisory，EWA），市场上销售的NPS 主要类别为氨基茚类、合成大麻素、合成卡西酮、苯环类物质、苯乙胺、哌嗪、植物性物质、色胺类和其他物质［1］。截至 2021 年 12 月，134 个国家和地区已向 UNODC EWA 咨询报告了1 124种关于NPS的物质，这给进行滥用药物检测的法医实验室提出了重大挑战［1］。NPS 进入体内后通常被广泛代谢，生物检测时（特别是在尿液检测中）应侧重于代谢物［3］。因此，代谢研究对于检测方法开发是必不可少的。出于伦理考虑和缺乏临床前安全数据，人体研究无法进行，真实的人体样本往往无法获得，只能在真实案例获得少量样本［4］。为了解决这个问题，研究者们使用了各种体外或体内模型进行代谢物研究［3，5-6］。

斑马鱼是一种小型硬骨鱼（3~4 cm），通常来自淡水；最初是由 Streisiger 等［7］在 20 世纪 80 年代早期作为一种动物模型引入遗传学研究。目前斑马鱼已经成为生物研究领域包括发育生物学、毒理学、药物发现、疾病模型和神经生物学等的流行动物模型［8-20］。斑马鱼具有与人类同源性高、体积小、易于维护、成本低等优势［6］，非常适于NPS药理学、毒理学、代谢等方面的研究，已成为研究NPS代谢的重要工具。本文在介绍斑马鱼代谢模型优势的基础上，总结了近年来其在NPS 代谢研究方面的应用进展，旨在为NPS研究提供借鉴。

1 斑马鱼代谢模型的建立

在欧洲，斑马鱼胚胎直到成熟才被视为实验动物，所以为避免伦理学问题，倾向于使用斑马鱼胚胎造模［21］。而在巴西、中国和印度，所有用于研究的动物都受到伦理方面的保护［22］。有学者评估了斑马鱼幼体在不同成熟阶段产生异源代谢物的能力［23-26］。研究表明，成年斑马鱼在产生异物代谢物方面更为有效［27-28］，所以现在一般采用成年斑马鱼进行实验。一般将成年斑马鱼随机分为两组，包括空白斑马鱼组（不含NPS）和实验组。将斑马鱼放入充满溶液的容器中，在溶液中接触NPS，并规定Ⅰ相和Ⅱ相的浸泡时长。也有通过微量注射的方式对斑马鱼幼虫进行给药，但碍于斑马鱼体型过小，操作难度较高，且在卵黄囊注射所得的实验结果并不好［29］。之后Park 等［30］显微注射了斑马鱼4 个部位（尾静脉、心室、后脑、卵黄囊），结果显示，除注射卵黄囊外，其他3 个途径给药的产生代谢物总量均比暴露在水中给药要多，且代谢速度快、丰度较高。总的来说，被动地将化合物送入水中仍然是最简单和侵入较少的给药方法。

2 斑马鱼模型在NPS代谢研究中的特点

斑马鱼是目前用于代谢研究的经典哺乳动物模型的一个可行的替代方案，作为NPS 代谢研究的动物模型，具有以下特点。

斑马鱼的基因组已经被测序，显示有70%的基因与人类有同源性［31-33］。除了与人类相似的组织和器官的形态和分子基础外，它还呈现出与哺乳动物类似的代谢过程［21］。斑马鱼能够同时进行第一阶段（氧化、N-去甲基化、O-去甲基化和去烷基化）和第二阶段（硫酸化和葡萄糖醛酸化）的代谢反应［23，28，31］。在体内药物代谢中发挥核心作用的是代谢酶［34］。Ⅰ期代谢酶主要是细胞色素P450（CYP）家族，在人的肝、胃肠道、肺和肾中大量存在，催化许多化学物质和内源性化合物的氧化和还原代谢，许多人类CYP 酶在斑马鱼中都有直接的同源基因［33-35］。此外，斑马鱼体内还存在人类中缺乏同源基因的细胞色素P450，例如细胞色素P1C、细胞色素 P450-AE 和细胞色素 P450-2X［33］。在第二阶段代谢过程中，来自第一阶段的化合物与转移酶结合：糖醛酸基转移酶（UGTS）、磺基转移酶（SULTs）、N-乙酰转移酶（NAT）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）、硫代嘌呤甲基转移酶（TPMTs）和儿茶酚-O-甲基转移酶（COMTs）［34，36］。葡萄糖醛酸化是主要的二期代谢途径，人体内40% ~ 70%的内源性和外源性化合物结合成葡萄糖醛酸化形式排泄出来［27］。在斑马鱼中，共鉴定出 45 个 UGT 基因，可分为 3 个家族，分别是 UGT1、UGT2 和 UGT5（含量最高），其中斑马鱼UG1 和UGT 2 家族和哺乳动物具有高度相似性［37-38］。

在NPS 代谢的研究中，传统方法是采用常规的哺乳类动物进行体内试验或者体外细胞实验。虽然大鼠、带有人源化肝脏的嵌合小鼠、猪都是成熟的动物模型［39-41］。但相较于斑马鱼模型，小鼠等模型的饲养成本较高，需要的饲养空间较大。与其他动物模型相比，斑马鱼有体型小、易维护、繁殖成本低和繁殖率高等优点。细胞体外实验的优点在于实验可控性高，干扰较少，但其代谢情况与人体会存在较大的差异；斑马鱼的体内环境及与人类基因的同源性保证了代谢情况的相似性。此外，使用斑马鱼模型预测新陈代谢的另一大优势是基质比尿液或其他动物模型更干净，这减少了LC-HRMS分析时的基质效应［42］。但目前大多数实验室没有使用斑马鱼进行研究的经验，没有固定的斑马鱼繁殖基地。斑马鱼和人类代谢之间的物种差异也可能会限制斑马鱼模型的发展。

3 斑马鱼在代谢研究中的应用

3.1 斑马鱼在药物代谢中的应用

斑马鱼在药物代谢研究中已有广泛的应用［43］。Alderton 等［27］研究了一些药物和常用的人细胞色素P450（CYPs）探针在斑马鱼幼体中的积累和代谢。对西沙必利、氯丙嗪、维拉帕米、睾酮和右美沙芬的研究表明，斑马鱼幼体催化Ⅰ相和Ⅱ相反应。与哺乳动物相比，斑马鱼幼体在代谢途径上既有相似之处，也有不同之处。在斑马鱼幼体中观察到非那西丁代谢为扑热息痛和右美沙芬代谢为右啡烷（在人类中分别由CYP1A2 和2D6催化的代谢反应）。此外，受精后7 d 的斑马鱼幼鱼对双氯芬酸、布洛芬、他克莫司和睾酮进行了羟基化。Li 等［44］观察了中药淫羊藿苷及其糖苷衍生物在斑马鱼幼体中的代谢和分布，鉴定了淫羊藿苷及其衍生物在斑马鱼体内的Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物，表明斑马鱼有CYP2 和CYP3A4酶的活性。

3.2 斑马鱼在NPS代谢研究中的应用

自2004 年以来，一种名为“Spice”的强效新型精神活性化合物开始在互联网上销售，被广泛用作大麻的替代品；直到2008年，全球各地的实验室才陆续从这些产品中发现CP-47497 和JWH-018，属于第一代合成大麻素（synthetic cannabinoids，SCs）［45-48］。合成大麻素作为合成大麻素受体激动剂（synthetic cannabinoid receptor agonists，SCRA），与已知的大麻素受体（CB1，CB2）结合，并产生类似 于 四 氢 大 麻 酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）的作用，THC 是天然大麻中唯一已知的精神活性成分。合成大麻素是目前NPS占比最大（60%以上）和消费最多的一类物质。我国是全球首个整类列管合成大麻素类物质的国家［49］。

Sardela等［50］最早使用斑马鱼水箱模型（zebrafish water tank，ZWT）对 JWH-073 的代谢进行了研究，观察到的代谢产物与人类的代谢产物相同。JWH-073 的人类尿液代谢物由细胞色素P450 CYP2C9 和CYP3A4 代谢，前者促进吲哚基团的单羟基化，后者促进烷基ω 位点的单羟基化，然后由UDP 葡萄糖醛酸转移酶对烷基链进行ω-羧化。由于斑马鱼中没有CYP2C9酶同源物，未观察到吲哚组中的单羟基化。Richter等［29］在2019年第一次使用斑马鱼幼虫对NPS 进行代谢研究。在向培养基中添加底物或向卵黄囊中微量注射底物后孵化斑马鱼幼仔，检测其代谢产物。结果显示，微量注射后仅检测到1种代谢物，在培养基提取物中发现了4种代谢物，在幼虫提取物中发现了另外14种代谢物。与通过培养基给药相比，使用微量注射的7'N-5F-ADB 总量要低得多，因为可以注射到幼虫体内的体积很小。但通过添加底物的斑马鱼观察到酰胺水解、酯水解、烷基链羟化和葡萄糖醛酸化等代谢反应，与pS9 和HepaRG 细胞相比提供了更多数量的代谢物，更接近真实的人类代谢物谱。XU 等［51］通过建立斑马鱼的体内代谢模型验证了人体肝脏微粒体的AMB-FUBINACA 的代谢途径。在人类肝脏微粒体系统中共鉴定了17 种AMBFUBINACA 的体外代谢物，在斑马鱼模型中检测到16 种代谢物。肝脏微粒体样品中检测到的4 种最丰富的AMB-FUBINACA 酯水解和羟基化代谢物，在斑马鱼模型中都能检测到。2021 年，学者采用斑马鱼模型对新型合成大麻素MDMB-CHMINACA［52］、4F-MDMB-BICA［53］、5F-MDMB-PICA［54］和 4FMDMB-BUTINACA［55］的体内代谢转化途径进行研究并确定了滥用监测的生物标志物。Morales-Noé等［56］使用斑马鱼幼虫模型和液相色谱-高分辨率串联质谱（LC-HRMS/MS），研究了5 种第3 代合成大麻素（MMB-CHMICA，ADB-CHMICA，ADB-CHMINACA，MDMB-CHMCZCA 和 NNL-3）的代谢物，并推断其代谢途径。这几种合成大麻素是对JWH-018 4 个亚结构（吲哚环、甲酮连接基、萘核和戊基尾）之一进行改造，形成吲哚或吲唑核心，烷基侧链（戊基侧链、环己基），部分通过酰胺与核心相连（如3，3 二甲基丁酸甲酯，MDMB）等。这类化合物是合成大麻素中最丰富、最普遍的一类，而且还在不断涌现。因结构相似，也有类似的代谢途径模式。此类合成大麻素优先在烷基侧链上代谢（羟基化），具有氟烷基侧链的合成大麻素主要在末端碳上代谢，形成羟基化和随后的羧酸。另外酯键的水解、MDMB 上的羟基化、脱烷基、N-脱氢也是主要的代谢途径。

Gampfer 等［57］研究了 2 种芬太尼类 NPS 4F-Cy-BAP，Fu-BAP 在人肝S9 组分（pHLS9）和斑马鱼幼虫体内的代谢。通过液相色谱高分辨率-串联质谱初步鉴定出4F-Cy-BAP 的Ⅰ期和Ⅱ期代谢物7 个，Fu-BAP 的Ⅰ期和Ⅱ期代谢物15 个，其中大部分在斑马鱼幼虫中检测到，分别为7 个和16 个。N-脱烷基、N-脱酰化、羟化和N-氧化是最丰富的代谢反应，相应的代谢产物可以成为毒理学分析的靶标。作者进行了同工酶的研究，斑马鱼缺少的代谢物正是由CYP2C 和CYP2D 酶所代谢的羟基化的异构体，而CYP2C 和CYP2D 是斑马鱼所缺少的CYP酶。在哺乳动物中，间氯苯基哌嗪（mCPP）可以与黑色素结合，并通过Ⅰ期氧化和Ⅱ期葡萄糖醛酸化和硫酸化消除。斑马鱼幼虫中mCPP 的生物转化与哺乳动物一致，通过氧化将mCPP 转化为OH-mCPP，然后与葡萄糖醛酸结合［58］。mCPP 与斑马鱼眼中的黑色素结合，分布含量最高；并发现斑马鱼的吸收速率是人吸收的40 倍，可能与人类的肠道屏障比斑马鱼幼体的皮肤屏障或鳃更强有关。此外，作者还研究了mCPP 在斑马鱼中的代谢动力学，实验结果得到吸收速率常数Kin为（112.9 ±7.4）L/（kg·h）和消除速率常数Kout为（0.25 ±0.03）h-1。1%~2%的母体化合物在相同的时间内经历了氧化和葡萄糖醛酸化反应，这与吸收动力学分析的时间相符。2020 年，Wagmann 等［59］采用pHLS9、HepaRG 细胞和斑马鱼幼虫对4F-MDMBBINACA，4-DMA-NBOMe，ephylone，4F-PHP 和 1PLSD 5 种物质进行了对比代谢研究。在斑马鱼幼虫中检测到的代谢物最多（总共79 个代谢物，第一阶段58 个，第二阶段21 个），形成的4F-MDMBBINACA、ephylone 和 4F-PHP 丰度最高的代谢物在人类生物样本中也是丰度最高。然而，一些代谢物只由斑马鱼幼虫形成，可能表明人类和斑马鱼之间酶的差异。总体来说，斑马鱼幼虫代谢实验与人类血浆和尿液分析中发现的代谢物数据最吻合，证明了斑马鱼幼虫作为阐明NPS 代谢研究工具的潜力。

3.3 斑马鱼和其他代谢模型中NPS代谢反应比较

Ⅰ相代谢反应可分为氧化水解还原3 类。羟基化是斑马鱼中NPS代谢最常见的反应，NPS结构中碳原子可氧化成羟基，如果烷基链上含有F，一般会氧化脱氟为羟基再进一步氧化成酸。另外有脱烷基化（脱酰基）、脱氢和N-氧化。水解有酯水解和酰胺水解，酯水解反应出现的次数仅次于羟基化，其产物也通常被指定为标志物，酰胺水解较为少见。还原反应占一小部分，仅有碳基的还原。斑马鱼体内NPS Ⅱ相代谢物的数量较多，同分异构体代谢物较少。Ⅱ相代谢反应有葡萄糖醛酸化和硫酸化，NPS代谢物种类葡萄糖醛酸化远多于硫酸化，推测和斑马鱼体内两种酶的数量有关。与哺乳动物相比，斑马鱼的代谢途径、代谢产物和数量都有差异。斑马鱼中代谢物多是单步反应，多个代谢步骤形成的代谢物不如在真实人体样本中丰富［29］，但是人体滥用生物标志物在斑马鱼体内都能检出。

斑马鱼体内的代谢酶具有与哺乳动物系统相似的氧化和结合的代谢活性，对合成大麻素来说，斑马鱼产生的代谢物数量常多于其他代谢模型（pHLS9、HLM、人肝细胞）［59］。斑马鱼模型也能代谢产生特有的NPS 代谢物，代谢物差异与同工酶的种类有关［50，57］。5F-MDMB-PICA 中斑马鱼反应数量多于人肝细胞，斑马鱼特有的代谢反应集中在脱烷基化后吲哚环羟基化和5-氟戊基侧链羟基化以及二者的葡萄糖醛酸化和硫酸化，而人肝细胞特有反应多是不同位置的二次羟基化，二者有共同的标志性代谢反应酯水解（酯水解产物通常为 推 荐 标 志 物）［54，60］。 MMB-CHMICA、MDMBCHMCZCA 和ADB-CHMINACA 3 个合成大麻素都是以斑马鱼幼虫为模型进行代谢，由于斑马鱼幼虫代谢能力弱于成年斑马鱼，所以在代谢反应的数量和步骤上少于所对比的体外代谢模型，但在关键代谢反应与体外代谢模型一致［56］。在MDMBCHMCZCA 中，斑马鱼相比于真实尿液样本缺少了环己基羟基化的后续步骤（环己基二羟基化+酯水解/脱氢，环己基羟基化+叔丁基羟基化/叔丁基酸化），但推荐代谢标志物（环己基羟基化和咔唑羟基化）与真实尿液样本一致［56，61］。在 4F-MDMBBINACA 的Ⅰ相代谢反应中，斑马鱼幼虫集中在内酯的形成（内酯的形成+N-脱烷基/氧化脱氟/氧化脱氟变丁酸/叔丁基羟基化），而真实尿液样本集中在酯水解（酯水解+吲唑环羟基化/丁基羟基化/氧化脱氟变丁酸/叔丁基羟基化）［55，62］。在斑马鱼幼虫体内检测到18 种代谢反应（Ⅰ相有14 种，Ⅱ相有4 种），酯水解、内酯的形成和氧化脱氟+氧化成羧酸是丰度最高的3个反应。在所调查的模型中，斑马鱼幼虫反应数量最多［59］。在7'N-5F-ADB 中，斑马鱼与真实尿液样本的差异主要在酯水解反应的数量上［30，63］。PX-2 中斑马鱼和人肝微粒体的各自独有反应数量很少，几乎全是共同代谢反应（酰胺水解，氧化脱氟+苯丙氨酸损失，氧化脱氟）［64］。

在其他类型的NPS 中（芬太尼、苯乙胺、合成卡西酮类等），斑马鱼的代谢物种类数量并不占优势。在卡西酮类似物ephylone 和4F-PHP 以及3，4-DMA-NBOMe（苯乙胺类）的研究中，斑马鱼幼虫、pHLS9、HepaRG细胞和真实尿液样本作比较，虽然反应数量上与真实尿液样本相差较大，但相较于其他模型，斑马鱼与真实尿液样本中发现的代谢反应和信号强度最为相似［59，65］。1P-LSD 是麦角酸酰胺类的迷幻药物，代谢反应主要是脱丙酰基化和不同位置羟基化的组合。在反应数量上斑马鱼和人肝脏S9 组分差异悬殊，可能是个体间代谢差异造成［59］。在戊酰芬太尼（valerylfentanyl）的研究中［66］，人肝微粒体模型共有19种代谢反应，虽然斑马鱼较数量上少于人肝微粒体，但在标志性代谢反应上二者高度吻合（N-脱烷基化和羟基化等），为斑马鱼作为芬太尼相关化合物代谢模型提供了支持。

4 总结与展望

由于新出现的NPS 的人体数据不易获得，因此有必要通过体内和体外代谢模型对NPS 代谢进行系统研究。斑马鱼是一种新型脊椎类动物模型，具有与人类同源性高、用药量少以及花费较低等特点，现已广泛运用于人类相关疾病和药物研究。本文概述了斑马鱼代谢模型在NPS 的应用，显示出了斑马鱼模型在NPS 代谢方面巨大的应用潜力。但是，关于NPS 的斑马鱼行为和代谢研究仍较为匮乏。体内的代谢情况能提供部分毒代动力学信息，有助于评估斑马鱼模型在NPS 的适用性，而行为效应对于阐释NPS 的作用机制也有相当大的帮助；此外，以往研究大多集中在合成大麻素类，其他类型的NPS 较少涉及；且斑马鱼与人体之间的差异也需要进一步深入的探索。