尼莫地平对颅脑损伤模型大鼠早期血管生成的影响及其机制研究*

高继英，石代乐，王鹏飞，李永，张玉，乔建新，张秀峰，刘春江，刘熙鹏

（河北北方学院附属第一医院1.神经外科高压氧舱室，2.神经外科，3.医学影像中心，河北张家口075000）

颅脑损伤是一种常见创伤，其神经功能恢复关系到患者预后及生活质量[1]。血管新生是颅脑损伤后神经功能修复的重要部分，早期血管生成能改善局部供应血液，为脑组织提供营养物质，修复神经功能[2-3]。尼莫地平是一种二氢吡啶钙通道拮抗剂，能有效透过血脑屏障。有研究显示，尼莫地平能够改善患者认知功能，推测其对脑部神经功能恢复具有一定作用[4-6]。目前，临床上关于尼莫地平对颅脑损伤模型大鼠早期血管生成的研究较少，因此本研究通过复制颅脑损伤大鼠模型，探究尼莫地平对颅脑损伤模型大鼠早期血管生成的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级、8 周龄、SD 雄性大鼠25 只，体重185～215 g，平均（200±15）g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010，实验动物使用许证号：SYXK（冀）2019-0040。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂尼莫地平（亚宝药业集团股份有限公司，国药准字H14022821，规格：20 mg），戊巴比妥钠（上海桥星贸易有限公司，CAS 号：57-33-0），中性多聚甲醛（常州贝源鑫生物科技有限），大鼠CD34 免疫组织化学试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司），大鼠低氧诱导因子lα（hypoxia inducible factor-lα， HIF-lα）、促血管生成素2（Angiopoietin-2，Ang-2）酶联免疫试剂盒（上海一基实业有限公司），兔抗大鼠Akt、PI3K 及ERK1/2 单克隆抗体、山羊抗兔Akt、PI3K 及ERK1/2 二抗（上海酶研生物科技有限公司）。

1.2.2 主要仪器-80℃低温冷藏箱（南京贝登医疗股份有限公司，型号：HD-86L830），离心机（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号：M1324R），石蜡切片机（北京佳源兴业科技有限公司，型号：HS-3315），电泳仪（上海土森视觉科技有限公司，型号：164-5056）。

1.3 方法

1.3.1 颅脑损伤模型大鼠的复制及分组随机选取8 只大鼠作为对照组，其余大鼠复制颅脑损伤模型[7]。大鼠称重后，均腹腔注射2% 戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉。根据自由落体打击损伤法：剔除大鼠顶枕部毛，常规消毒后沿中线切开头皮，分离软组织，将颅骨暴露于视野中，在保证硬脑膜完整的前提下，于人字缝前约2 mm，中线旁约2 mm 处，做一直径为4 mm 的圆形骨窗，采用小锤（致伤力度为25 g）于25 cm 高度下落，落于右侧硬脑膜，造成颅骨损伤，用骨蜡封闭颅骨损伤区域，并缝合头皮，观察大鼠生命体征、角膜反射、肢回缩、后肢屈曲反射，以翻正反应出现、自行爬动作为模型复制成功。

模型复制过程中1 只大鼠死亡，其余大鼠随机分为模型组和尼莫地平组，每组8 只。术后所有大鼠正常饲养，尼莫地平组给予1 mg/（kg·d）尼莫地平，连续灌胃7 d；对照组和观察组给予等量生理盐水。

1.3.2 标本采集及处理治疗结束后，采集大鼠股动脉血5 ml，室温下放置1 h，2 000 r/min 离心10 min，离心半径10 cm，提取上清液，置入-80℃冰箱冷冻保存。所有大鼠用10%水合氯醛溶液进行麻醉，迅速断头处死，打开颅腔取脑，避免损伤脑组织与硬脑膜，将各组4 只大鼠右侧脑组织置于4%中性多聚甲醛固定，用于CD34 免疫组织化学和苏木精-伊红（hematoxylin-eosin， HE）染色。取出另外4 只大鼠右侧脑组织后，迅速置于液氮中10 min，然后于-80℃冷藏箱中保存，用于检测蛋白相对表达量。

1.3.3 大鼠神经功能评分根据Zea-longa 评分[8]，将大鼠行为分为8 个等级，评分为0～7 分，大鼠无不对称活动为0 分；提尾后，大鼠右侧前肢不能伸展完全为1 分；提尾后，前侧右肢不能伸展完全同时活动障碍为2 分；大鼠右侧前肢贴胸为3 分；大鼠活动时明显向右转弯为4 分；向右转弯同时右侧前爪向后拖地为5 分；原地右转圈为6 分；无法站立，只能右侧躺为7 分。

1.3.4 大鼠血管内皮细胞数及微血管密度（microvessel density, MVD）检测取固定后的脑组织，脱水后石蜡包埋，将损伤部位及其周围组织切片（厚4 μm），按照CD34 免疫组织化学试剂盒说明书进行染色，血管内皮细胞为浅棕或棕黄色的颗粒为CD34 阳性，单个内皮细胞为1 个血管单位，随机选取5 个高倍视野，观察并计算每个视野内皮细胞数和MVD[9]。

1.3.5 大鼠血清HIF-lα、Ang-2 水平检测取上层血清，采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清HIF-lα、Ang-2水平，并严格按照HIF-lα、Ang-2 ELISA 试剂盒说明书进行操作[10]。

1.3.6 大鼠脑组织病理检查取固定后的脑组织，脱水后石蜡包埋，切片约4 μm 厚，HE 染色后置于光镜下，观察大鼠脑组织病理学变化[11]。

1.3.7 Western blotting 检测Akt/ERK 通路蛋白的表达取液氮保存的脑组织，研磨成匀浆后，加入裂解液，离心后取上清液进行蛋白浓度测定。加入上样缓冲液后进行电泳，分离蛋白质，转膜后采用脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入兔抗鼠一抗，4℃孵育过夜，冲洗后，再加入羊抗兔二抗，室温孵育1h，经ECL 显影得到结果[12]。目的蛋白与β-actin 蛋白灰度值的比值为蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.2 大鼠神经功能评分比较

对照组、模型组、尼莫地平组大鼠神经功能评分分别为（0.00±0.00）分、（4.42±0.61）分和（2.57±0.78）分，经方差分析，差异有统计学意义（F=120.607，P=0.000）。进一步两两比较结果：模型组、尼莫地平组高于对照组（P＜0.05）；且模型组高于尼莫地平组（P＜0.05）。

2.2 大鼠血管内皮细胞数和MVD比较

对照组、模型组、尼莫地平组大鼠血管内皮细胞数和MVD 比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：模型组、尼莫地平组均多于对照组（P＜0.05）；且模型组均少于尼莫地平组（P＜0.05）。见表1。

表1 3组大鼠血管内皮细胞数及MVD比较 （n=8，±s）

表1 3组大鼠血管内皮细胞数及MVD比较 （n=8，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别对照组模型组尼莫地平组F 值P 值MVD/（条/mm2）6.08±0.95 8.82±0.68①12.11±1.87①②44.998 0.000血管内皮细胞数/（个/HP）68.19±6.28 113.92±5.58①156.25±6.83①②397.108 0.000

2.3 大鼠血清HIF-lα、Ang-2水平比较

对照组、模型组、尼莫地平组大鼠HIF-lα、Ang-2水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：模型组、尼莫地平组均高于对照组（P＜0.05）；且模型组均低于尼莫地平组（P＜0.05）。见表2。

表2 3组大鼠血清HIF-lα、Ang-2水平比较（n=8，ng/mL，±s）

表2 3组大鼠血清HIF-lα、Ang-2水平比较（n=8，ng/mL，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别对照组模型组尼莫地平组F 值P 值Ang-2 11.83±6.14 39.82±9.35①79.85±12.26①②101.842 0.000 HIF-lα 14.19±4.28 45.92±5.58①84.86±7.31①②292.246 0.000

2.4 大鼠脑组织的病理检查结果

对照组脑组织结构完整，神经元细胞及神经纤维整齐排列。模型组损伤部位出现细胞和血管坏死，神经元细胞周围肿胀，细胞间隙增大，部分神经元细胞凋亡，毛细血管肿胀，管壁结构部分破损。尼莫地平组脑组织部分神经细胞死亡，水肿减轻，神经细胞排列略微紊乱，部分细胞仍见细胞质凝集，局部可见血管着色密集。见图1。

图1 3组大鼠脑组织病理切片 （HE×400）

2.5 大鼠Akt/ERK通路蛋白相对表达量比较

对照组、模型组、尼莫地平组大鼠PI3K、pAkt/Akt、（pERK1/2）/（ERK1/2）蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：模型组、尼莫地平组均高于对照组（P＜0.05）；且模型组均低于尼莫地平组（P＜0.05）。见表3和图2。

表3 3组大鼠Akt/ERK通路蛋白相对表达情况比较（n=8，±s）

表3 3组大鼠Akt/ERK通路蛋白相对表达情况比较（n=8，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别对照组模型组尼莫地平组F 值P 值（pERK1/2）/（ERK1/2）0.41±0.02 0.59±0.04①0.81±0.03①②377.655 0.000 PI3K 0.22±0.03 0.55±0.06①0.89±0.04①②441.574 0.000 pAkt/Akt 0.24±0.04 0.48±0.06①0.72±0.06①②157.091 0.000

图2 大鼠脑组织Akt/ERK通路蛋白的表达

3 讨论

血管新生是颅脑损伤后神经功能修复的重要机制，能够为受损区域的组织及细胞提供营养物质，改善血液循环，加速脑组织及神经功能的修复[13-14]。有研究显示，血管生成与脑部损伤的预后有关，因此血管生成成为脑部疾病研究的新热点[15]。治疗性血管生成是指通过药物促进血管生成[16]。尼莫地平一般用于改善急性脑血管病的血液循环，在早期血管生成方面研究较少，本研究通过复制颅脑损伤模型大鼠，探究尼莫地平通过Akt/ERK 通路对早期血管生成的影响，为颅脑损伤后的疾病恢复提供证据支持。

本研究对各组大鼠神经功能进行评估，通过神经修复体现血管新生情况，结果显示模型组大鼠神经功能损伤，而尼莫地平对神经损伤具有一定的修复作用。内皮细胞数和MVD 能够反映血管新生的强度，本研究中，模型组内皮细胞数和MVD 多于对照组，表明在颅脑损伤后，机体会形成部分新生血管，而尼莫地平组内皮细胞数和MVD 均多于对照组和模型组，提示在尼莫地平的作用下，血管的新生作用更强。

HIF-lα 为低氧诱导因子，在缺氧条件下能够调节多种基因，具有改善能量代谢、减少脑组织及神经细胞受损的作用，同时HIF-lα 能促进血管生成。有研究证实，HIF-lα 对改善脑缺血再灌注的严重程度和预后有重要意义[17]。Ang 家族因子促进血管新生的作用更强，Ang-2 是Ang 家族因子中的一种分泌型因子[18]。相关研究表明，正常情况下Ang-2 仅表达于血管重建部位，其在组织损伤修复过程中具有重要意义，Ang-2 在VEGF 的作用下能够诱导内皮细胞增殖、转移，促进新生血管的形成[19]。本研究中尼莫地平组Ang-2 明显高于对照组和模型组，提示尼莫地平对颅脑损伤模型大鼠早期血管生成有促进作用。

本研究对大鼠脑组织进行病理检查，结果显示对照组脑组织结构完整，神经元细胞及神经纤维整齐排列；模型组损伤部位出现细胞和血管坏死，神经元细胞周围肿胀，细胞间隙增大，部分神经元细胞凋亡，毛细血管肿胀，管壁结构部分破损。经尼莫地平给药后，脑组织部分神经细胞死亡，水肿减轻，神经细胞排列略微紊乱，部分细胞仍见细胞质凝集，局部可见血管着色密集，表明在尼莫地平的作用下，脑组织神经受损情况明显改善，并有新生血管形成。

Akt/ERK 通路包括PI3K/Akt 信号通路和ERK1/2信号通路。PI3K/Akt 通路中，Akt 通常为失活状态，磷酸化后活化，形成pAkt，能够激活PI3K/Akt 通路，其中Akt 参与细胞增殖、凋亡，而PI3K 是细胞中重要的信号蛋白，能够调控Akt 的活化[20]。ERK1/2 能够传导丝裂酶原信号，激活后形成pERK1/2，能调控细胞核内的转录因子，刺激多种转录因子磷酸化，增强转录活性，加速细胞的增殖、转移，有利于血管的新生[21]。本研究中，模型组pAkt/Akt、PI3K及（pERK1/2）/（ERK1/2）蛋白表达上调，表明大鼠颅脑损伤后，部分通路被激活，而尼莫地平组Akt/ERK 相关蛋白表达均上调，提示Akt/ERK 通路在莫地平的作用下被激活。

综上所述，尼莫地平能够促进颅脑损伤模型大鼠早期血管生成，其作用机制可能与Akt/ERK 通路有关。本研究仅表明Akt/ERK 通路可能与颅脑损伤模型大鼠早期血管生成有关，为进一步验证Akt/ERK 通路在颅脑损伤模型大鼠早期血管形成中的作用，后续可将该通路上下游蛋白敲除，进行深入研究，为颅脑损伤的治疗提供更充分的证据支持。