异氟醚吸入麻醉调控星形胶质细胞活化对围术期小鼠神经认知功能的影响

2022-04-07 06:43徐兰真
武警医学 2022年3期
关键词:性反应海马小鼠

彭 景,徐兰真

围术期神经认知紊乱(perioperative neurocognitive disorder,PND)是围术期发生的以学习记忆等认知功能下降为主要表现的神经精神并发症,发生率约为10%。老年患者术后1周PND发病率可达25.80%,约为青年患者10倍以上。PND发病机制尚未完全明确。越来越多证据显示,麻醉应激反应是PND的重要诱因。异氟醚具有血/气分布系数小、麻醉诱导平稳、迅速且舒适、肝脏代谢率低等优点,为目前临床常用的吸入性全身麻醉药物。但近年临床应用发现,异氟醚可通过抑制突触前膜对兴奋性递质谷氨酸释放,增加突触后膜对谷氨酸摄取,改变N-甲基-D-天门冬氨酸受体亚基构成,进而影响相关记忆形成过程。星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的脑细胞,亦是体积最大的胶质细胞。既往研究表明,星形胶质细胞可通过调节突触可塑性,与神经元形成代谢偶联,维持神经系统内环境稳态。有研究发现,星形胶质细胞活化与PND发生密切相关。本研究旨在探讨异氟醚是否通过调控星形胶质细胞活化对围术期小鼠神经认知功能影响,为防治PND提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6小鼠 80只,SPF级,雄性,16月龄,平均体质量(44.69±1.32)g,购自武汉大学动物实验中心,实验动物许可证号SCXK(鄂)2019-0004。分笼喂养,适应性喂养1周后进行相关实验,环境温度(24±2)℃,相对湿度60%~70%,光照/黑暗各12 h,自由饮食和饮水。

1.1.2 试剂与仪器 异氟醚(国药准字X19990127):美国Abbott Laboratories公司。RIPA裂解液(货号XG-R95815)、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(货号XG-X6561):上海西格生物科技有限公司。Triton X-100溶液(货号R00284):北京雷根生物技术有限公司。小鼠BCA蛋白ELISA试剂盒(货号YT14144)、山羊血清(货号YT2517):北京伊塔生物科技有限公司。小鼠抗TNF-α单克隆抗体(货号ab1793)、小鼠抗IL-6单克隆抗体(货号ab9324)、小鼠抗Caspase-3单克隆抗体(货号ab208161)、兔抗β-actin多克隆抗体(货号ab8227)、小鼠抗GFAP单克隆抗体(货号ab279290)、山羊抗小鼠IgG H&L二抗(货号ab96879):美国Abcam公司。DAPI染液(货号EY19202):上海一研生物科技有限公司。小鼠IgG-ECL显色试剂盒(货号SW2010):北京索莱宝科技有限公司。水迷宫:上海玉研仪器公司,内径120 cm,高50 cm,站台直径6~9 cm。激光共聚焦显微镜(型号SP8 X):北京德利卡生物技术有限公司。全自动凝胶成像分析系统(型号ZF-288):上海金鹏分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备小鼠随机分为对照组、2%异氟醚组、手术组、2%异氟醚+手术组,每组20只。对照组小鼠以4%水合氯醛,腹腔注射,0.2 ml/20 g,吸入30% O-空气2 h,假手术。2%异氟醚组小鼠以4%水合氯醛,腹腔注射,0.2 ml/20 g,吸入30% O-空气和2%异氟醚2 h,假手术。手术组小鼠以4%水合氯醛,腹腔注射,0.2 ml/20 g,吸入30% O-空气2 h,行胫骨骨折切开复位固定术。2%异氟醚+手术组小鼠以4%水合氯醛,腹腔注射,0.2 ml/20 g,吸入30% O-空气和2%异氟醚2 h,行胫骨骨折切开复位固定术。

1.2.2 术后认知功能 通过Morris水迷宫实验评估小鼠术后1、3、7 d认知功能。水池内注入25 ℃温水,水深25 cm,平台低于水面1 cm以上;将小鼠置于随机象限,术前1 d训练小鼠站台,随后记录术后1、3、7 d小鼠找到平台所用的时间,即为逃避潜伏期,以及小鼠在平台所在象限停留时间,即为目标象限停留时间;实验期间保持环境安静,避免干扰其活动。

1.2.3 标本采集 Morris水迷宫实验结束后,4%水合氯醛,腹腔注射,麻醉后断颈处死小鼠,取完整脑组织;冰上分离双侧海马组织,-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 蛋白免疫印迹法 取海马组织,RIPA溶液裂解组织,提取总蛋白,BCA法进行蛋白定量;取40 μg蛋白样品,SDS-PAGE电泳后,湿法转至PVDF膜;5%脱脂奶粉,室温封闭1 h;分别滴加TNF-α、IL-6和Caspase-3抗体,1∶2000,内参为β-actin,1∶45 000,4 ℃过夜孵育;TBST洗膜2次,每次5 min;ECL法显影,凝胶成像系统观察,Image J软件定量分析蛋白相对表达量。

1.2.5 免疫荧光染色 取海马组织,4%多聚甲醛固定48 h,0.9%无菌氯化钠溶液漂洗30 min;常规制备石蜡切片,厚度5 μm;二甲苯脱蜡,乙醇溶液梯度水化,擦拭切片周围液体;免疫组化笔距离组织2 mm处画圈;置于0.4%Triton X-100溶液中,室温孵育10 min,PBS溶液冲洗3次,每次5 min;修复抗原,高压锅加热至限压阀冒气90 s,冷水降压,自然冷却后,PBS溶液冲洗3次,每次5 min;滴加5%山羊血清,37 ℃封闭10 min;滴加小鼠GFAP单克隆抗体,4 ℃过夜孵育;滴加山羊抗小鼠IgG H&L二抗,37 ℃避光孵育1~2 h;弃去抗体反应液,置于脱色摇床上,PBS溶液冲洗3次,每次5 min;阻水圈内滴加DAPI染液,避光孵育5 min;PBS溶液冲洗3次,每次5 min;90%甘油封片,激光共聚焦显微镜(400×)下观察GFAP阳性细胞数,并拍照。

1.2.6 TUNEL法检测细胞凋亡 取海马组织石蜡切片,依次脱蜡、水化;置于蛋白酶K工作液,室温反应15~30 min;滴加TUNEL反应液,室温避光孵育60 min;PBS溶液冲洗3次,每次5 min;荧光显微镜下观察,随机选取5个视野,计数TUNEL阳性细胞。

2 结 果

2.1 小鼠术后认知功能比较 术后1、3、7 d,与对照组比较,2%异氟醚组和手术组小鼠逃避潜伏期显著增加,目标象限停留时间显著缩短(<0.05);术后1、3、7 d,与2%异氟醚组和手术组比较,2%异氟醚+手术组小鼠逃避潜伏期显著延长,目标象限停留时间显著减少(<0.05,表1)。

2.2 小鼠术后海马组织炎性反应和凋亡相关因子水平比较 术后1、3、7 d,与对照组比较,2%异氟醚组和手术组小鼠海马组织TNF-α、IL-6和Caspase-3表达水平显著升高(<0.05);术后1、3、7 d,与2%异氟醚组和手术组比较,2%异氟醚+手术组小鼠海马组织TNF-α、IL-6和Caspase-3表达水平均显著升高(<0.05,表2)。

2.3 小鼠术后海马组织星形胶质细胞活化情况比较 术后1、3、7 d,与对照组比较,2%异氟醚组和手术组小鼠海马组织GFAP阳性细胞数显著增加(<0.05);术后1、3、7 d,与2%异氟醚组和手术组比较,2%异氟醚+手术组小鼠海马组织GFAP阳性细胞数显著增加(<0.05,表3,图1)。

2.4 小鼠术后海马神经元细胞凋亡比较 术后1、3、7 d,与对照组比较,2%异氟醚组和手术组小鼠海马神经元细胞凋亡率显著增高(<0.05);术后1、3、7 d,与2%异氟醚组和手术组比较,2%异氟醚+手术组小鼠海马神经元细胞凋亡率显著增高(<0.05,表4)。

3 讨 论

PND是麻醉手术后常见的中枢神经系统并发症,主要表现为学习、记忆、注意力等认知功能下降。大多学者认为,神经炎性反应和星形胶质细胞活化是PND发生以及进展的重要原因。异氟醚是一种临床常用的吸入性麻醉药物,其麻醉效能介于氟烷和安氟醚间,安全性和可控性相对较高。但研究发现,异氟醚吸入麻醉过程中,对中枢神经系统具有抑制作用,且抑制程度与吸入浓度呈显著正相关。冯海妹等发现,异氟醚麻醉可通过激活糖原合成酶激酶-3β活性,诱发老龄大鼠认知功能障碍和炎性反应。Miao等亦发现,异氟醚和手术可降低AD转基因小鼠突触后密度-95、突触素和三磷酸腺苷水平,增加Barnes迷宫探针试验的逃逸潜伏期和逃逸距离,导致小鼠大脑能量不足进而引发认知障碍。

马斌等分析了不同浓度和作用时间异氟醚对幼年小鼠神经功能影响发现,相较于1.5%异氟醚,2%异氟醚吸入麻醉2 h可显著引起小鼠神经细胞凋亡,导致神经认知功能损伤。故本研究采用2%异氟醚作为实验剂量,进一步分析异氟醚对围术期小鼠认知功能的影响及机制。Morris水迷宫实验是研究空间学习记忆相关脑区功能的方法。秦起等发现,麻醉手术可引起大鼠逃避潜伏期显著延长,目标象限活动时间显著缩短。本研究中,术后1、3、7 d,与对照组比较,2%异氟醚组和手术组小鼠逃避潜伏期显著增加,目标象限停留时间显著减少,符合以往研究结果,提示麻醉和手术应激可引起围术期小鼠认知功能下降;而与2%异氟醚组和手术组比较,2%异氟醚+手术组小鼠术后1、3、7 d逃避潜伏期进一步增加,目标象限停留时间进一步减少,提示异氟醚吸入麻醉具有加重小鼠认知功能下降作用。

麻醉药物对机体代谢具有一定影响,可诱发应激反应和炎性反应。文献[16]报道,异氟醚麻醉下行肝部分切除术可导致老年大鼠海马炎性反应。有研究报道,异氟醚麻醉下行肝部分切除术可导致老年大鼠海马炎性反应。Miles等发现,异氟醚吸入麻醉可导致颅内手术患者脑脊液TNF-α和IL-6等炎性因子水平显著升高,并在术后神经损伤中发挥重要作用。本研究发现,术后1、3、7 d,与对照组比较,2%异氟醚组和手术组小鼠海马组织TNF-α、IL-6和Caspase-3表达水平和海马神经元细胞凋亡率显著升高,符合以往研究结果,提示麻醉和手术应激可诱发机体炎性反应及神经元细胞凋亡;而与2%异氟醚组和手术组比较,2%异氟醚+手术组小鼠术后1、3、7 d海马组织TNF-α、IL-6和Caspase-3表达水平和海马神经元细胞凋亡率进一步升高,且海马星形胶质细胞减少,GFAP阳性细胞数显著增加,表明异氟醚吸入麻醉可加重围术期小鼠神经炎性反应及神经元细胞凋亡水平,机制可能与促进海马星形胶质细胞活化有关。

综上所述,异氟醚吸入麻醉可引起围术期小鼠认知功能下降,其机制可能与促进海马星形胶质细胞活化,诱导神经元凋亡,加重神经炎性反应水平有关。线粒体是细胞物质和能量代谢的中心,线粒体能量代谢紊乱亦是导致PND发生的重要因素。本研究未验证和探讨异氟醚对线粒体能量代谢的影响及其机制,拟在今后研究中进一步分析。

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