三峡库区不同沉积土微生物多样性分析

程飞，张潇雪，胡武静，肖国生，吴应梅，杜慧慧,2*

(1.重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404120；2.三峡库区可持续发展研究中心，重庆 404120)

三峡工程的运行承载着长江中下游的防洪与生态安全。三峡大坝建成以来，其水环境中的物理、化学和生物等因素均有一定程度的改变[1]，对三峡库区的生态和水文环境造成深远影响[2]。三峡水库作为一种特殊水库生态系统[3]，带动着库区经济、城镇化、工业化的发展，人为干预及三峡工程的运行对库区环境均造成直接影响。水环境微生物作为水生生态系统的主要参与者，不仅参与重要的生物化学反应，而且在水生食物网中具有关键性作用，而水位的波动可能会影响微生物群落在生物化学反应中的作用。因此，水体微生物以数量大、种类多和适应能力强等备受关注[4]。水生环境的变化影响着库区微生物，进而影响着淡水生态系统功能的发挥和人类健康[5]。研究该区域微生物群落组成，可为监测库区环境变化和水生生态功能提供重要的数据支撑。

水域中的底泥是物质迁移和转化的场所，而泥沙携带大量的污染负荷累积到底泥中，对三峡水库和长江水质构成潜在危害[6]。底栖微生物群落结构的变化是衡量水体环境变化和演替的标志，同时底泥中的微生物也会影响水环境质量[7]。因此，研究三峡库区腹地万州段微生物群落结构和多样性，有助于全面了解三峡库区水生态系统与水环境质量状况。现采集三峡库区万州段不同沉积土样品，结合生物信息学分析该区段微生物数量及物种多样性，为致病菌的筛选及防治提供数据参考，也为库区生态环境的合理利用和治理奠定基础。

1 研究方法

1.1 仪器与试剂

仪器：隔水式智能恒温培养箱(GHP-9080，上海一恒科学仪器有限公司)；超净工作台(SW-SJ-2F，青岛明博环保科技有限公司)；电子天平(FA1004，上海良平仪器仪表有限公司)；高压灭菌锅(2540MK，山东博科再生医学有限公司)；聚合酶链式反应仪(Proflex 3x32 ABI，美国赛默飞世尔科技公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)。

试剂：无水乙醇(分析纯)；低熔点琼脂糖(A8350-100g)；溴酚蓝(B8120-5g)；溴化乙锭(EB)核酸染料(G5560)；50×电泳缓冲液(50×TAE，T1060)、DNA Marker试剂 D2000 DNA Ladder(M1060)；牛肉膏蛋白胨培养基(G8270-500g)；马丁肉汤琼脂培养基(LA4810)；高氏Ⅰ号培养基(LA7000)。以上试剂均购自北京索莱宝科技有限公司，根据《微生物学实验》[8]附录配制及灭菌。

1.2 样品采集

于2018年3月23日在三峡水库万州段长江二桥两岸的4个采样点进行沉积土的采集，其中二桥南为新区，人口较少，而二桥北为万州老城区，人口较密集，样品点位信息见表1。用灭菌后的专用采土器以多点混合法采集0～20 cm处的沉积土，分别装入灭菌广口瓶，封口，6 h内冰袋低温带回实验室，4 ℃保存备用。

表1 沉积土样品点位信息

1.3 沉积土理化性质分析

将采集的沉积土取一部分风干、过筛备用。用pH计测定沉积土的pH值，烘干法测定沉积土的含水率，重铬酸钾容量法测定土样的有机质含量[9]。

1.4 微生物群落测定

微生物培养：称取土样10 g放入装有90 mL无菌水的锥形瓶中，加入无菌玻璃珠，充分振荡30 min，得到10-1菌悬液，10倍倍比稀释，依次稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6个梯度，每个稀释度设置3个重复。细菌使用牛肉膏蛋白胨培养基于37 ℃培养24 h，放线菌使用高氏Ⅰ号培养基于28 ℃培养3～5 d，真菌使用马丁肉汤琼脂培养基于28 ℃培养2～3 d。

沉积土中微生物数量的计数[10]：每1g沉积土中微生物的数量=平板菌落数/(稀释度×菌液量)。根据菌落的大小、颜色和形态等挑取单个菌落纯化后，采用甘油冻存和牛奶冻存2种方法于-80 ℃冰箱中保藏菌种。

1.5 细菌16S rDNA全序列的测定

将分离纯化后的细菌进行16S rDNA序列测定。使用细菌提取基因组试剂盒提取纯化后细菌的基因组，以细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)利用聚合酶链式反应 (PCR)扩增各菌的16S rDNA区序列[11]，扩增片断长度大约是1.5 kb PCR产物，PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6 进化树构建

将细菌16S rDNA序列提交至美国国家生物信息中心(NCBI，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行核酸氨基酸序列相似性比较分析，选取相似度99%以上的物种进行命名，使用多序列比对Clustal W法进行多序列比对，使用MAGEX10.1.8软件以邻接法构建系统进化树，自举法1 000次检测进化树的可靠性。

2 结果与分析

2.1 不同沉积土理化性质

不同沉积土理化性质见表2。由表2可见，水上、水下土样的pH值、有机质、有机碳和含水率均存在差异。不同沉积土的pH值均呈弱碱性。水下沉积土(T5、T7)有机质、有机碳含量以及含水率均高于水上沉积土(T4、T6)。沉积土理化性质的差异可能对微生物的数量造成一定的影响。

表2 沉积土理化性质

2.2 沉积土中微生物的数量

不同点位沉积土中微生物的数量分布情况见图1。由图1可见，不同沉积土中细菌、放线菌和真菌的数量存在差异，而T4、T6和T5、T7样品中微生物的数量差异较小。细菌、放线菌和真菌的数量分别为7.05～7.59 log10CFU/g，4.77～4.98 log10CFU/g，3.28 ～3.49 log10CFU/g。沉积土微生物总数表现为：细菌>放线菌>真菌。长江二桥南、北两岸水上和水下的真菌和放线菌的数量没有明显差异。

图1 不同沉积土样品中微生物的数量分布

2.3 分子鉴定与系统进化分析

从不同沉积土分离的细菌中，选取菌落形态、大小、颜色等差异明显的31株细进行16S rDNA鉴定。将所测序列提交至NCBI，进行Blast比对，选取相似度和覆盖度>99%进行物种命名。T4、T6中分离的细菌多为假单胞菌属(Pseudomonas)，T5样品中分离的细菌多为未培养微生物(Uncultured bacterium clone),有7株。T7中分离的细菌种类较多，有不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、贪铜菌属(Cupriavidus)和芽孢杆菌(Bacillus)。随后构建菌株系统进化树见图2，图中进化树上的数字表示该分支的置信度，数值越大越可信，物种后的大写字母和数字代表分离株。

由图2可见，T5底泥分离的细菌多聚为一枝，为未培养微生物(Uncultured bacterium clone)的不同分离株。而T4和T6样品中分离的多为假单胞菌属(Pseudomonas)聚为一枝。T7底泥中细菌的种类多，分属不同的分支中。由此可知，万州二桥北的沉积土样品中的细菌种类多，可能与人类活动有关。二桥南属新区，城镇人口相对较少，且江岸地势较陡直，人类活动较少；而江北属人口密集区、有大量排污口、江岸平缓、有较多大湾回水区、人类活动较频繁。

3 结论

通过采集三峡库区万州段南、北两岸4个不同沉积土样品，发现不同沉积土的有机质含量存在差异，结合微生物数量和分子生物学鉴定分析得到，不同沉积土样品中微生物数量表现为细菌>放线菌>真菌，且优势细菌为假单胞菌属和不动杆菌属。

4 讨论

沉积土中微生物能够敏感地反映沉积土中生态系统的微小变化，微生物可通过自身代谢活动影响沉积土-水生生态系统的物质循环，同时也在水环境保护方面发挥重要的作用[12-13]。水体沉积物中含有的污染物，如重金属、微生物等，再次被悬浮会增加水体有害物质的浓度，影响水质[14]。微生物多样性是反映该群落结构变化的关键指标，而研究土壤微生物群落结构的变化是研究土壤质量和环境变化的重要依据[15]。随着人口的增长和经济的发展，越来越多的工农业废水排放至水库等水生系统中，从而导致微生物的沉积、水体富营养化等。细菌群落的组成和多样性会随水质的变化而变化[16]，直接影响库区各种物质和能量的代谢，尤其对环境敏感的微生物。细菌结构的变化不仅与环境有关，还与水库周边地区和支流的微生物种群有关[17]。另外，微生物的组成和丰富度与沉积土深度有关，江岸沉积土和沉积土的微生物也存在差异。常规的微生物培养方法只能检测出样品中最丰富的物种，但结合分子生物学技术能够尽可能有助于了解微生物多样性。

图2 三峡库区可培养菌的系统进化树

宏基因组测序和高通量基因芯片(Geochip)测序技术检测微生物信息量大，包含微量的细菌，是研究环境微生物群落的重要方法。通过Alpha多样性和Beta多样性分析发现，位于江北城镇人口密集的回水区的微生物丰度和多样性高于江南或上游水体中微生物的多样性，推测该区域水体受外界影响较大，如废水排放，导致微生物的生长和繁殖高于其他区域[18]。邓运佳[19]通过分离鉴定出9种微生物与宏基因组分析微生物多样性结果一致。JIN等[20]采用培养法和16S rRNA测序分析发现污水处理厂中膨胀污泥的细菌群落中γ-变形菌是该菌群的优势菌。因此，采用培养法和高通量测序法可以为微生物组成和多样性分析提供理论依据。在今后研究中，将结合分子生物学方法分析三峡库区不同区域微生物多样性，以期为进一步研究三峡水库水生态环境的微生物多样性、生态健康状况、污染防控等提供可靠参考。