甜菜BvPT1;4和BvPHO1基因的克隆和生物信息学分析

王晓丹, 李 杰, 刘 宇, 丁广洲,*

(1.黑龙江大学 现代农业与生态环境学院, 哈尔滨 150080; 2.黑龙江省甜菜技术创新中心, 哈尔滨 150080; 3.国家糖料改良中心, 哈尔滨 150080)

0 引 言

对于所有生命体来说，磷(P)是磷脂、核酸和 ATP 的主要组成元素，也是酶反应和信号转导过程的调节因子[1]。植物以无机磷酸盐(Pi)的形式获取磷，由于无机磷酸盐分布不均匀，溶解性低，在土壤中存在很低的水平(<10 μM)。因此，施用化肥已经成为农业生产中确保作物生产力的做法[2-3]。这导致了不可再生的磷矿资源岩储量迅速下降，如按照目前的速度开采，只可持续50～100 a。磷肥的过度使用造成土壤中难溶性磷的积累，威胁到粮食生产，以及土壤磷流入水体后导致水体富营养化，带来了系列生态环境问题[4]。因此，挖掘促进磷高效吸收的基因资源，探讨植物高效吸收磷素的分子机制，提高低磷条件下植物吸收磷素的能力，具有重要的生态和经济价值[5]。

磷酸盐转运蛋白能够调节植物对磷的吸收和转运，对提高植物磷利用率具有重要作用。在植物中，磷酸盐转运蛋白(PT)被分为 PHT1，PHT2，PHT3，PHT4，PHT5 和 PHO1 家族[6]。PHT1和PHO1 是质膜磷酸盐转运蛋白，PHT2，PHT3，PHT4，PHT5 是细胞内转运蛋白[7-9]。Wang D等首次从拟南芥[8]中克隆出植物的PHT1家族基因，并与酿酒酵母 PHO84进行了序列同源性分析。近年来在水稻、烟草、马铃薯、大豆、大麦、玉米、小麦、番茄、高粱和杨树等植物体中均发现了PHT1s的同源性，如拟南芥的AtPT1;1、AtPT1;4、小麦TaPT1;1、TaPT1;3、大豆GmPT1;8、水稻OsPT1;8等在植物体内的表达模式及对植物吸收的影响已被报道。PHO1蛋白主要参与 Pi 从根部向地上转运，具有长的细胞质 N-末端，含有3部分SPX结构域，具有EXS 结构域的细胞质C-末端和6个跨膜螺旋。EXS 结构域负责PHO1的信号传导能力和Pi转运活性[10-11]。

甜菜(Beta vulgaris L.)属藜科甜菜属，作为世界上最重要的糖料作物之一，且在我国北方农业生产中占据重要地位[12]。甜菜种植主要分布在高寒地区，特别是东北地区, 土壤肥沃，有机磷含量高, 但直接可利用的游离无机正磷酸盐(土壤有效磷)含量一直处于较低水平[13]。正由于土壤中有效磷含量有限[14]，高效利用磷的甜菜品种对于甜菜的大规模生产和新品种的选育与开发具有重要意义。迄今为止，低磷胁迫下的甜菜生理响应已有报道，但是涉及甜菜耐低磷相关基因的表达模式研究较少，对甜菜PTs磷酸盐蛋白基因家族的研究鲜见报道。本研究从甜菜中克隆出磷酸盐转运蛋白基因BvPT1;4和BvPHO1，并运用生物信息学方法对BvPT1;4和BvPHO1蛋白的理化性质分析，对甜菜磷酸盐转运蛋白基因深层次的功能研究具有一定的借鉴作用，同时为培养甜菜的优良品种提供了候选基因。

1 材料与方法

1.1 植物材料和生长条件

以甜菜磷高效品种‘B8033’为材料，为催芽选取饱满、大小均匀的甜菜种子浸泡过夜(12 h)。在1∶600的福美霜溶液浸泡6 h, 然后用蒸馏水洗净备用。将种子放在72孔穴盘中培养至子叶完全展平后开始移苗，将甜菜幼苗移入盛有改良版1/2Hougland完全营养液玻璃槽中。在温度 25 ℃、光照16 h、黑暗8 h、湿度25%的条件下培养20 d。

1.2 基因的克隆

1.2.1 引物设计

根据NCBI和转录组的序列数据来获得甜菜BvPT1;4和BvPHO1基因的序列，利用Primer 5.0 软件设计特异性引物(表1)，将设计好的引物送至上海生工生物股份有限公司合成。

表1 甜菜磷转运蛋白基因克隆所用引物

1.2.2 RNA提取和cDNA合成

取适量甜菜幼嫩叶片置于预冷的研钵中，加入适量的液氮充分研磨。采用Trizol法提取甜菜的总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。利用核酸蛋白仪Nanodrop2000测定OD260和 OD280，根据 OD260/OD280比值的质量。按照TIANGEN逆转录试剂盒说明书步骤获得cDNA。

1.2.3 甜菜BvPT1;4基因的克隆和测序

由反转录得到的cDNA为模板，用引物进行扩增。25 μL按照说明书设置反应体系，为：PrimeSTAR Max Premix(2×)12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O为9.5 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min，98 ℃变性10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，变性-退火-延伸为1个循环，连续30个循环，然后在 72 ℃延伸5 min。将PCR产物进行1%凝胶电泳检测，回收目的片段，-20 ℃保存备用。扩增产物进行纯化后与pMD19-T Vector连接。转化感受态细胞，经过菌落PCR检测后，挑选阳性克隆菌液送至上海生工进行测序。

1.3 生物信息学分析

通过在线软件ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)预测甜菜BvPT1;4和BvPHO1蛋白的氨基酸组成、正负电荷残基数、亲水平均系数等理化性质[10]，使用跨膜螺旋预测工具TMHNM Serverv2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白跨膜结构域；利用 NCBI 中的 CDD 数据库(conserved domain database)预测甜菜BvPT1;4和BvPHO1蛋白的保守结构域；利用Blastp在线工具查找甜菜BvPT1;4和BvPHO1蛋白的同源氨基酸序列，并使用DNAMAN 7.0软件多重比对同源氨基酸序列；利用软件MEGA7制作进化树。利用软件Prabi(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测BvPT1;4和BvPHO1蛋白的二级结构；利用软件SignalP(http://ww w.cb s.dtu.dk/services/SignalP/)在线预测与BvPT1;4和BvPHO1蛋白的信号肽；用SWISSMODEL(https://swiss model.expasy.org/interactive)在线预测工具预测BvPT1;4和BvPHO1蛋白三级结构；应用网站NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/servic-es/NetPhos/)预测BvPT1;4和BvPHO1蛋白的磷酸化位点；利用WOLFPSORT(https://www.genscript.com/tools/wolf-psort)预测BvPT1;4和BvPHO1蛋白的亚细胞定位信息[15-18]。

2 结果与分析

2.1 甜菜幼苗RNA的的提取

Trizol法提取甜菜幼苗总RNA，采用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1(a)，提取的RNA 28S、18S和5S条带清晰表明RNA质量良好。分光光度计检测RNA的A260/A280比值在1.9～2.0，说明RNA纯度较高，满足后续实验要求。

2.2 甜菜BvPT1;4和BvPHO1基因的扩增

以上述提取的甜菜幼苗RNA反转录的cDNA为模板，用设计的引物进行基因扩增。扩增结果见图1(b,c)。由图1可见，甜菜BvPT1;4基因PCR扩增获得产物长度约为1 600 bp,BvPHO1基因产物长度约为2 400 bp。切胶回收，克隆转化，获得测序结果BvPT1;4基因为1 581 bp，BvPHO1基因为2 394 bp。基因产物的大小与引物设计时基因产物相符。

图1 甜菜幼苗总RNA电泳检测(a)和甜菜PT基因基扩增 M:2 000 bp DNA ladder(b,c)

2.3 甜菜PT基因编码蛋白的理化性质预测分析

甜菜PT蛋白理化性质分析见表2。BvPHO1和BvPT1;4蛋白分别编码797、526个氨基酸，分子量分别为91 910.50 Da、57 859.43 Da。理论等电点(pI)分别为9.24、8.76，均大于7，为碱性蛋白质。不稳定系数均小于40，为稳定蛋白质。相对较高的脂肪系数可以维持蛋白质良好的稳定性，有助于在不同环境中发挥正常的功能。总平均亲水性分析表明BvPHO1的值为负数，说明BvPHO1为亲水性蛋白，BvPT1;4的值为正数，说明BvPT1;4为疏水性蛋白。

表2 甜菜PT蛋白理化性质分析

2.4 甜菜PT基因编码蛋白疏水性、磷酸化位点、信号肽、亚细胞定位预测分析

利用在线软件ProtScale预测BvPHO1和BvPT1;4编码蛋白的亲疏水性见图2。由图2可见，BvPHO1蛋白在第385位亲水性最强，在第532位疏水性最强；BvPT1;4蛋白在第515位亲水性最强，在第472位疏水性最强。BvPHO1和BvPT1;4蛋白氨基酸的分值分别为负值和正值，则推断BvPHO1和BvPT1;4分别为亲水和疏水蛋白，与所预测的理化性质结果一致。甜菜BvPHO1蛋白中共87个氨基酸磷酸化位点，其中有55个丝氨酸，23个苏氨酸和9个酪氨酸。甜菜BvPT1;4蛋白含有25个丝氨酸磷酸化位点，23个苏氨酸磷酸化位点和6个酪氨酸磷酸化位点，共54个磷酸化位点见图3。两者均发生在丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸上，且磷酸化位点个数都是丝氨酸最多。推测BvPHO1和BvPT1;4蛋白可通过其磷酸化修饰调控其活性，与甜菜PT的功能相关。BvPHO1和BvPT1;4蛋白均不存在信号肽，可推测不是分泌蛋白。甜菜PT蛋白的亚细胞定位预测结果，BvPHO1和BvPT1;4在质膜、叶绿体和细胞核中均可能存在。其中BvPHO1在质膜中存在的概率为71.4%，在细胞核中存在的概率为14.3%；BvPT1;4在细胞核中存在的概率为71.4%，在叶绿体中存在的概率为21.4%。

图2 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白亲/疏水性预测

图3 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白磷酸化位点预测

2.5 甜菜PT基因编码蛋白保守结构域、跨膜结构域、二级结构、三级结构预测分析

甜菜PHT蛋白的保守结构域分析表明：甜菜BvPHO1蛋白具有高度保守的SPX和EXS 超家族结构域，BvPT1;4蛋白的保守结构域为2A0109，这两个结构域为磷酸盐转运蛋白家族的必要结构，发挥转运蛋白的功能。通过对甜菜PHT蛋白跨膜结构域预测，得知甜菜BvPHO1和BvPT1;4蛋白分别有7、11个跨膜结构域，均为跨膜蛋白(图4)。对蛋白二级结构进行预测，在蛋白BvPHO1和BvPT1;4中，α-螺旋结构共计分别为445、258个氨基酸,占比分别为55.83%、49.05%；延伸主链结构最少，分别为64、82个氨基酸，仅占8.03%、15.59%；无规则卷曲结构共计分别为264、168个氨基酸,分别占33.12%、31.94%。甜菜BvPHO1、BvPT1;4蛋白三级结构均以α-螺旋和无规则卷曲为主，其与二级结构预测结果一致(图5)。

图4 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白跨膜结构域预测

图5 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白三级结构预测

2.6 甜菜PT基因编码蛋白系统进化分析

为研究甜菜BvPHO1和BvPT1;4与其它物种磷酸盐转运蛋白的进化关系，利用NCBI的BlastP工具分析甜菜BvPHO1和BvPT1;4蛋白与其相似度较高的序列进行构建系统进化[15]。进化树分析结果表明，甜菜BvPHO1蛋白与藜麦(Chenopodium quinoa)、菠菜(Spinacia oleracea)、芝麻(Sesamum indicum)、小果咖啡(Coffea arabica)的磷酸盐转运蛋白亲缘关系最近。BvPT1;4蛋白与藜麦(Chenopodium quinoa)、菠菜(Spinacia oleracea)、杜鹃(Rhododendron simsii)、圆叶杜鹃(Rhododendron williamsianum)的高亲和磷酸盐转运蛋白亲缘关系较近。

3 讨 论

通过克隆甜菜BvPHO1和BvPT1;4基因并且对该基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析，发现BvPHO1蛋白含有PHO1家族蛋白中高度保守的SPX(SYG1/PHO81/XPR1)-EXS结构域，此类结构域已经在拟南芥和水稻的液泡Pi转运蛋白中被发现，以维持Pi稳态。BvPT1;4蛋白含有526个氨基酸残基，蛋白分子质量为58.1 ku，等电点 8.76，是一个定位在质膜上疏水性、无信号肽的非分泌性蛋白，含有高亲和力磷酸转运蛋白典型的 11个跨膜域和一个大亲水环的跨膜结构。甜菜作为世界上最重要的糖料作物之一，且在我国北方农业生产中占据重要地位，同时也是最具竞争力和潜力的经济作物。正由于土壤中有效磷含量有限，高效利用磷的甜菜品种对于甜菜的大规模生产和新品种的选育与开发具有重要意义。

4 结 论

本研究通过克隆甜菜BvPHO1和BvPT1;4基因并且对该基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析，BvPHO1蛋白含有SPX(SYG1/PHO81/XPR1)-EXS结构域，对维持植物体内Pi稳态至关重要。BvP71;4蛋白具有高亲和力，可有效利用土壤中的磷元素。研究结果为进一步探索甜菜PT基因深层次的功能研究提供方向，也为培养甜菜的改良品种提供了候选基因，具有一定的学术价值。