miRNA-15a及miRNA-182在脓毒血症中的表达与疾病严重程度和预后的关系

施孝海 黄志平 刘卫怀 陆志峰 高捷 张俊峰

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征[1]。脓毒症每年影响全球数百万人，导致其中高达四分之一甚至更高的人死亡[2]。早期发现并采取适当的治疗可以改善预后。微小RNA（microRNA，miRNA）是一组新的小分子（20～24个核苷酸）。畸变的miRNA 表达与感染、炎症和脓毒血症有着密切的相关性[3]。已有研究显示miR-15a 及microRNA-182（miR-182）在脓毒症的诊断与预后预测上具有较高的临床应用价值[4]，有可能成为脓毒症的新兴生物标志物之一，但缺乏其在脓毒症患者中的动态变化特征的相关研究。本次研究旨在探索循环miR-15a 及miR-182 在脓毒症患者中的表达特点及其与脓毒症的严重程度和预后的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019 年12月至2021 年3月宁波市北仑区人民医院外科重症监护室和普通外科病区收治的脓毒症患者。入组标准为：①脓毒症的诊断标准符合第三版关于脓毒症和脓毒症休克定义的国际共识[5]；②自愿参加本次研究；③年龄18岁以上，80岁以下。排除标准为：预计24～48 h 内可能出院的。研究方案经本院伦理委员会批准。所有参与者或其监护人签署知情同意书。共有55例患者被纳入本次研究，其中男性35例、女性20例；年龄36～78岁，平均年龄（61.10±10.00）岁；感染部位：腹腔28例、泌尿系11例、肺部14例、其他部位2例；合并症分布：慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）10例、心肌病史12例、慢性肾病5例、肝硬化2例。

1.2 方法 收集入组患者的一般临床资料，包括年龄、性别、吸烟、COPD 史、心脏病史、慢性肾功能衰竭史、肝硬化史，检测血红蛋白（hemoglobin，Hb）、白细胞（white blood cell，WBC）、C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原（procalcitonin，PCT）等水平，并进行序贯器官衰竭评估（sequential organ failure assessment score，SOFA）等。所有入组患者随访28 d，记录28 d内预后结果。

研究对象分别在入组后0 h、24 h、48 h 及72 h用抗凝管采集血样。所有血样采集后立即进行血浆分离处理。离心后，收集血浆并在-80°C下储存直至测定。使用实时荧光定量聚合酶链反应（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）测定血浆中miR-15a 及miR-182 的相对表达。并计算72 h 与0 h 的CRP、PCT、miR-15a 与miR-182的差值。比较脓毒症组与脓毒症性休克组及28 d 内生存组与死亡组在CRP、PCT 及miR-15a与miR-182 等方面的差异，以及与CRP、PCT、miR-15a、miR-182动态变化之间的关系。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 进行统计分析。正态资料采用均值±标准差（）表示，采用t检验；偏态资料采用中位数（四分位数法）表示，采用惠特尼U检验；计数资料采用例（%）表示，采用χ2检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 55例患者诊断为脓毒症28例、脓毒症性休克27例。两组患者入组时临床指标和miR-15a、miR-182相对表达量比较见表1

由表1 可见，两组患者在性别、感染部位、年龄、入组时WBC、CRP 等方面比较，差异均无统计学意义（χ2=0.01、2.09，t分别=-1.09、-1.94、-1.12，P均＞0.05）；两组在合并症方面（COPD、心肌病史、慢性肾病及肝硬化）比较，差异均无统计学意义（χ2分别=0.00、0.00、1.86、2.15，P均＞0.05）。在入组时，脓毒症组患者的Hb 高于脓毒症性休克组（t=3.45，P＜0.05），PCT 水平和SOFA 评分低于脓毒症性休克组，差异均有统计学意义（t=-2.78，Z=642.00，P均＜0.05）。脓毒症组miR-182 相对表达量明显低于脓毒症性休克组，差异均有统计学意义（t=-5.81，P＜0.05），而两组的miR-15a 相对表达量比较，差异无统计学意义（t=-1.21，P＞0.05）。

表1 两组患者入组时临床指标比较

2.2 55例患者28 d 内死亡10例，生存45例。两组患者临床特征比较见表2

由表2 可见，两组患者在性别、感染部位、年龄等方面比较，差异均无统计学意义（χ2分别=0.07、2.31，t=-0.68，P均＞0.05）。在合并症方面，生存组患者合并慢性肾病的例数少于死亡组，差异有统计学意义（χ2=6.47，P＜0.05），其余合并症，组间比较，差异均无统计学意义（χ2分别=1.15、0.48、1.41，P均＞0.05）。

在0 h 时，生存组的CRP、PCT 水平和SOFA 评分均低于死亡组（t分别=-2.97、-2.05，Z=79.00，P均＜0.05）。miR-182相对表达量要明显低于死亡组（t=-3.92，P＜0.05），两组的miR-15a 相对表达量比较，差异无统计学意义（t=-0.93，P＞0.05）。在72 h时，生存组患者的CRP、PCT 水平和SOFA 评分均低于死亡组（t分别=-4.28、-3.95，Z=5.50，P均＜0.05）。miR-182 相对表达量明显低于死亡组，miR-15a 相对表达量明显高于死亡组（t分别=-5.31、3.31，P均＜0.05）。

2.3 CRP、PCT、miRNA 表达动态变化特点与脓毒症患者28 d预后关系见表3

由表3 可见，生存组患者72 h 的CRP、PCT、miR-182 的下降程度明显大于死亡组，差异均有统计学意义（t分别=-3.12、-3.51、-10.19，P均＜0.05）；miR-15a 的回升程度明显大于死亡组，差异有统计学意义（t=11.19，P＜0.05）。

表3 CRP、PCT、miRNA表达的动态变化与患者28 d预后关系

3 讨论

脓毒症在重症监护室和腹部外科中是一种较为常见且致命的全身炎症反应综合征，早期诊断和治疗能明显提高患者的预后。然而，目前临床实践中的生物标志物如CRP、PCT 和白介素-6 对脓毒症的早期诊断和预后还不够敏感或特异性不高[6]。因此，探索有助于脓毒症的诊断和预后分析的生物标志物具有较高的临床价值。

目前，在脓毒症发生机制中，越来越深刻的遗传机制已经被发现，其中miRNA 在脓毒症病因学的调节中发挥着重要作用[3]。miRNA 在脓毒症的免疫反应和炎症调节中发挥着重要作用[4]，被认为是基因表达调节网络中的一个重要组成部分。畸变的miRNA 表达被认为是一种过度调节机制，如发育、衰老、细胞死亡等，但是也会抑制一些复杂疾病如感染、炎症和脓毒症[3]。与传统的蛋白质标记物相比，miRNA 相对稳定，而且miRNA 相对较小，不经过后处理修饰，化学结构不那么复杂。研究发现，在感染患者的血液中存在miRNA 的表达谱。已经被证实有许多miRNA 在脓毒症患者中存在表达的上调或下调[4]。本次研究结果也证实以上结论。

miR-182 最早由Vasilescu 等[7]发现，同健康受试者相比，脓毒症患者的miR-182 表达存在明显的上调。Moore 等[8]的动物实验证实，在大鼠模型中miR-182 存在表达上调，进一步通过生物信息学方法认为，miR-182 能够影响脓毒症相关信号通路的表达。Zhou等[4]在2015年再次确认了在人类脓毒症患者中miR-182 表达的上调。本次研究结果进一步发现miR-182 的高表达与疾病的严重程度相关，而miR-182 的高表达也与患者的预后密切相关。miR-182 作为一种促炎基因，能促进器官损伤。Vasilescu 等[9]通过对脓毒症患者的循环miRNA 表达网的预测，认为miR-182 能够影响脓毒症相关基因，比如ATP13A3、CDKN1A、GSK3B等基因的表达，进一步证实了这个推测。

miR-15a 是一种炎症相关的miRNA，据在各种疾病中发挥抗炎作用，能通过直接靶向VEGF 和FGF 抑制血管生成[10]。但循环miR-15a 在脓毒症患者的表达特点的观点仍有分歧。Goodwin 等[11]研究认为，同脓毒症组相比miR-15a 在脓毒症性休克患者中表达存在下调。miR-15a 可能通过几种潜在机制影响内皮功能障碍和休克的发展。目前，有研究发现miR-15a 可以靶向和抑制在脓毒症环境中增加血管通透性的基因，包括VEGFA、VEGFC 和Mylk[12]。因此，降 低miR-15a 的水平可以解除对这些基因的抑制，从而促进休克的发生。与之相反的是，Wang 等[13]研究认为，miR-15a 是新生儿脓毒症诊断和预后的潜在生物标志物，miR-15a 表达的上调能够抑制脂多糖诱导的炎症通路。这些矛盾的研究结果提示，miR-15a 在脓毒症中可能具有双向调节的作用。本次研究结果显示生存患者入院72 h、28 d miR-15a 的表达明显高于死亡患者，提示miR-15a 的高表达是预后改善的指标之一。

综上所述，miR-182 与miR-15a 可能可作为一种新型生物标志物，具有促进脓毒症患者的疾病分层和预后分析的临床应用价值。本次研究有几个局限性。首先，研究是在一个单一的中心进行的，由于患者大多来自国内的同一地区，可能存在选择偏差；其次，研究没有探究miR-182、miR-15a 促进脓毒症发展或进展的分子机制；第三，研究未评估长期临床结果。因此，多中心研究和较长的随访时间，以及体内和体外实验是进一步研究的方向。