CRISPR/Cas9基因组编辑技术在番茄中的应用现状及展望

蒋 萌，付尚谭，王晓峰

(西北农林科技大学 园艺学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨陵 712100)

近年来随着分子生物学的不断发展，基因编辑技术基于其高效、可控、定向编辑的特点在植物学和农学领域得到了广泛应用。该技术利用序列特异识别的核酸酶(sequence-specific nucleases，SSNs)使特定位点的DNA双链发生断裂，从而启动两种高度保守的自身修复机制，即非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组修复(homologous directed repair，HDR)。真核生物中DNA双链断裂(double strand break，DSBs)的修复多为NHEJ的方法，即通过DNA连接酶直接连接DSBs末端，但相比于需要同源序列模板的HDR，精确度更低[1]。基因编辑技术主要有3种类型，即锌指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)技术及规律成簇间隔短回文重复序列及其关联蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas)。与CRISPR/Cas相比，ZFNs和TALENs在编辑效率、稳定性、成本及复杂程度上都有其无法克服的缺点。

CRISPR/Cas技术2013年开始应用于植物基因组编辑，加速了人们对植物基因组中特定DNA序列定向编辑的步伐，被Science杂志评为十大科学突破之一[2]。其中应用最为广泛的是CRISPR/Cas9系统，目前已经在水稻、玉米、小麦等多种作物中得到应用[3-6]。

番茄(Solanumlycopersicum)是中国及世界上最主要的蔬菜之一，其生命周期较短，遗传简单，具备成熟的遗传转化技术。自2014年CRISPR/Cas9首次应用于番茄基因编辑后，在基因功能研究和种质资源创新领域得到了大量的应用[7]，但编辑效率低等问题依然限制了其进一步发展。本综述将总结近几年CRISPR/Cas9技术在番茄中的应用现状，并讨论该技术在番茄中应用的前景及面临的问题。

1 CRISPR技术简介

近年来，CRISPR/Cas9基因组编辑技术被广泛地应用于多种生物体的基因编辑，以对基因功能进行基础研究和创建动植物育种的新材料。从1987年在碱性磷酸酶同工酶基因中发现CRISPR序列后[8]，经过不断地探索和改进，最终将CRISPR/Cas基因编辑技术应用于编辑目标基因。根据Cas基因的数量和功能之间的不同，CRISPR/Cas系统被分为两类，第一类是需要多种蛋白的Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型系统，第二类是仅需单一蛋白即可编辑双链的Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型CRISPR/Cas系统[9]。目前应用最为广泛的是来自Ⅱ型CRISPR/Cas9系统，该系统主要由crRNA(CRISPR RNA)与tracrRNA(trans-activating crRNA)结合后形成双链二级结构进行Cas9蛋白的招募，共同形成活性核糖核蛋白(ribonucleoproteins，RNPs)复合体并识别PAM(protospacer adjacent motif)区，随后Cas9蛋白发挥其DNA核酸内切酶的活性，进行DNA双链的切割，由此产生DSB触发DNA修复机制。CRISPR/Cas9基因组编辑技术应用的核心是构建Cas9/sgRNA表达载体，将载体导入受体细胞并发挥编辑作用[10]，用于植物的Cas9核酸酶主要由35S启动子或组织特异性启动子等强启动子驱动，而sgRNA一般由聚合酶Ⅲ转录的U6启动子驱动，多重靶点编辑一般通过串联sgRNA连接至相应载体中表达[11-12]。随后通过农杆菌介导转化、农杆菌叶片注射法等方式导入受体细胞。

2013年，Science杂志报道了CRISPR/Cas9在小鼠等动物中的应用[13]，同年NatureBiotechnology杂志报道了在水稻、模式植物本氏烟草和拟南芥中的基因定点编辑[14-15]，并于2014年首次应用于番茄基因编辑[7]。目前，CRISPR/Cas9的应用主要集中在生物和非生物胁迫响应以及性状改良等方面，通过编辑编码序列位点产生无效等位基因突变体，最终应用于改良作物品种。

2 CRISPR/Cas9系统在番茄中的应用现状

CRISPR/Cas9技术近几年在番茄中的应用主要为农艺性状改良及抗逆、抗病基因功能研究，表1中列举了这三方面的应用。

表1 CRISPR/Cas9在番茄中的应用

2.1 CRISPR/Cas9在番茄农艺性状改良中的应用现状

番茄传统育种需要花费大量的时间和精力将优良性状赋于目标品系，还会连锁引入一些不需要的不良性状，而CRISPR/Cas9技术能够快速精准地创制应用于各品系各位点的新种质资源[16]。番茄基因组的测序使研究人员能够利用CRISPR/Cas9技术定点精确调控植株形态、生长发育、果实性状等农艺性状，从而得到优异的番茄种质资源。不仅如此，番茄作为一种研究浆果果实发育和果实成熟的模型，其性状改良对其他作物农艺性状改良也具有参考价值。

2.1.1 调控植株形态叶型影响番茄的植株形态和光合效率，Brooks等[7]利用CRISPR/Cas9技术编辑番茄SlAGO7基因，导致叶型发生改变，并发现突变能够稳定遗传，首次证明了CRISPR/Cas9系统在番茄中的强大功能。株高是作物重要农艺性状，矮化番茄植株较小，适宜盆栽，观赏价值高，CRISPR/Cas9编辑赤霉素信号转导的负调节因子PROCERA能够获得矮化突变体，自交获得T1代植株，杂合子在苗期表现出野生型和纯合子之间的中间表性，意味着突变为半显性，而发育后期纯合子杂合子矮化程度相同，随后通过自交获得了无Cas9构建的矮化番茄植株，为番茄优良矮化品种的培育提供了先例[17]。

2.1.2 改良果实性状果实作为番茄的经济器官，其性状直接影响生产者的经济效益，其中果实保质期的延长，果实品质及果色的改良对经济效益影响较大。

续表1 Continued Table 1

CRISPR/Cas9基因组编辑技术被应用于研究果实成熟相关基因功能，如RIN(ripening inhibitor)[18-19]、RING2[20]、ALC(alcobaca)[21]、ORRM4(organelle RNA recognition motif-containing 4)[22]以及NAM1[23]，敲除突变体果实延迟成熟，为培育货架期长的番茄耐贮藏品种提供材料。为了检测基因在果实发育中的特异功能，开发了果实特异性的CRISPR/Cas9系统，该系统以PPC2基因的启动子驱动Cas9基因表达，并结合GFP检测系统。使用该系统对植物发育产生多种影响的EZ2(zeste)基因进行编辑，对其在番茄果实中的功能进行探究，检测到果实成熟的延迟[24-25]，初步确认了果实特异性编辑的可行性，为番茄果实相关基因功能研究建立了新的研究方法。

可溶性糖是番茄果实品质中很重要的一个性状，INVINH1(inhibitor of the acid invertase gene)基因特异性抑制细胞壁转化酶活性，SlVPE5(vacuolar processing enzyme)负向调节糖的积累，均抑制果实可溶性糖积累。CRISPR/Cas9编辑验证SlINVINH1和SlVPE5功能，结果表明，比起SlINVINH1和SlVPE5单突变体，双突变体能进一步提高番茄果实中可溶性糖积累，二者表现为协同作用，为提高番茄果实品质提供实验依据[26]。此外，叶绿素数量增加能够通过增强光合作用提高植物的营养品质和果实颜色。Liu等[27]得到了一个叶绿素减少的突变体，发现是SlRCM1(reduced chlorophyll mutant 1)基因所导致，该基因的敲除系果实在绿熟期表现出黄色，为改善果实品质提供了一个新思路。番茄红素是决定番茄果实品质的重要因素，SGR1(stay-green1)、LCY-E(lycopene E-cyclase)、BLC(beta-lycopene cyclase)、LCY-B1(lycopene B-cyclase1)、LCY-B2是番茄红素代谢途径中的关键基因，设计6个sgRNA并利用CRISPR/Cas9系统进行敲除，其中sgr1单突变体的番茄红素含量增加约5.1倍，多重突变体也不同程度地增加了番茄红素和β-胡萝卜素的含量，在提升果实营养品质方面有实际应用价值[28]。

随着人们生活水平的提高，消费者对果色的要求也随之提高，粉果番茄更受中国消费者的欢迎。柚皮苷查尔酮(naringenin chalcone，NarCh)缺失造成番茄果实呈现粉色，对NarCh合成相关基因SlMYB12(myeloblastosis 12)进行编辑得到粉红果实突变体，且没有检测到突变体主要农艺性状及果实品质的变化，同时建立了基于CRISPR/Cas9系统的粉果番茄快速育种系统，为日后通过基因编辑改良农艺性状提供了一个很好的实例[29-30]。八氢番茄红素合酶(phytoene synthase，PSY)和类胡萝卜素异构酶(carotenoid isomerase，CRITOSO)参与类胡萝卜素合成途径，利用CRISPR/Cas9分别敲除红果番茄的PSY1和CRTISO，获得了黄色和橙色果实的突变体[31-32]。

2.1.3 调节生长发育番茄地上部分器官的分化和发育由茎端干细胞决定，CLV/WUS(clavata/wuschel)途径调控茎端分生组织的增值和分化。CLV3通过抑制WUS的表达限制干细胞增殖，SlCLE9(clavata 3/embryo)通过缓冲SlCLV3对干细胞增值的限制来维持干细胞稳态，使用CRISPR/Cas9编辑SlCLE9和SlCLV3发现双突变体表现出茎粗增大、叶片及分枝增多，并发现SlCLE9和SlCLV3之间的主动补偿效应[33]。Hendelman等[34]进一步研究WUS相关基因在发育中的调节功能，利用CRISPR/Cas9创造大量敲除SlWOX8(wuschel-related homeobox 8)和SlWOX9启动子等位基因的突变体，揭示了该基因在生长发育方面的多效性，同时发现了新花序表型。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的含量与发育相关，选择GABA代谢途径中的5个基因进行敲除，得到的多个突变体组合均能够显著提高GABA含量，抑制花、叶、果实的生长发育，验证了GABA在发育中的功能，证明了多敲系统的高效性[11]。此外，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteins kinases，MAPKs)在调节植物生长发育、分裂等过程发挥着重要作用，但其在植物发育过程中的功能还不清楚。利用CRISPR/Cas9彻底敲除SlMPK20，发现突变体花粉生存能力被抑制，探究了SlMPK20基因在花粉发育调控中的作用[35]。MIR(MICRORNA)基因转录后加工产物微小核糖核酸(MicroRNAs，miRNAs)，作用范围广泛，调控植物发育、生物非生物胁迫等生物过程。CRISPR/Cas9分别编辑miR164a、miR164b和miR164 d，发现miR164a影响果实大小硬度等性状，而miR164b能够维持花芽正常发育，并在果实生长调控中和miR164a发生冗余，揭示了miR164在发育和果实性状中的作用[36]。

2.1.4 雄性不育及单性结实品种培育番茄杂种优势明显，但杂交制种需大量人力物力，雄性不育系的创制能够节省这部分成本，同时提高杂交种子纯度。Du等[37]鉴定并敲除雄蕊特异基因SlSTR1创建了雄性不育系，并通过自交剔除了T-DNA，同时创建通过幼苗颜色区分育性的保持系，建立了基于CRISPR/Cas9的番茄杂交制种系统。最近我们团队使用CRISPR/Cas9技术靶向育性基因MS1035(male sterile)及其连锁的标记基因创建了具有绿色下胚轴标记或下胚轴多毛表型的雄性不育系。创制的不育系能够通过可视化标记在苗期区分出不育植株，且应用于杂交制种后能够获得高纯度杂交种，推动了CRISPR/Cas9在创制番茄雄性不育系及生产杂交种子中的应用[38]。近期研究发现，GDP-l-半乳糖磷酸化酶(GDP-l-galactose phosphorylase，GGP)调控抗坏血酸含量，CRISPR/Cas9诱导GGP突变导致植株花器官结构受损，进一步研究表明植株高抗坏血酸含量损害花粉活力，为雄性不育系的培育提供了新思路[39]。

单性结实即无需授粉子房直接形成无子果实，能够避免花粉活力对坐果率的影响。AGL6(agamous-like6)基因被证明与番茄单性结实有关，CRISPR/Cas9敲除AGL6产生了果实质量等性状未受影响的单性结实材料，验证了AGL6赋予番茄的单性结实能力[40]，并据此对SlAGL6介导的单性结实机制进行了深入研究[41]。类似的，Aux/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)转录因子SlIAA9的下调激活番茄单性结实，CRISPR/Cas9敲除获得的单性结实突变体显示出果实无核的表型，研究发现该突变能够稳定遗传至下一代，并快速应用于番茄各品种[42]。

2.1.5 多性状改良品种培育CRISPR/Cas9能够一次性编辑调控番茄生长发育、产量及营养方面的多个基因，同时优化番茄多个性状。Kwon等[43]利用CRISPR/Cas9同时编辑SlER(erecta)、SP(self-pruning)和SP5G(self-pruning 5G)，获得株型紧凑，外观更像灌木，40 d内能够收获成熟果实且不影响产量的番茄植株，创建了一种适宜城市农业的番茄材料，能够满足现代化都市生存与发展需要。野生番茄具有很好的抗逆性，但品质方面还需改良，Zsögön等[44]选择野生番茄品种，靶向其形态方面的6个基因，得到了大量形态、果实数量、果实形状及营养物质发生改变但保留了野生品种抗逆性的突变体。其次，该团队还提出利用CRISPR/Cas9技术能够使番茄产生辣椒素，提高番茄营养价值和抗菌能力[45]。这些结果表明了CRISPR/Cas9技术在番茄育种中具有很高的应用价值。

2.2 CRISPR/Cas9在提高番茄抗逆性中的应用现状

番茄生长发育经常面临干旱、高温、低温等多种逆境条件，严重影响番茄的正常生长发育，因此提高番茄抗逆性一直是育种的主要目标。CRISPR/Cas9技术推动植物抗逆相关基因功能及逆境胁迫机制等理论研究，并最终服务于番茄抗逆育种。

2.2.1 提高抗旱性干旱是对番茄生长发育最具破坏性的非生物胁迫。MAPK级联系统通过信号转导参与调节植物抗旱反应。CRISPR/Cas9诱导的SlMAPK3突变体中，检测到了过氧化氢的含量减少及热胁迫耐受性降低[46]，此外，病原体防御反应调控因子SlNPR1(nonexpressor of pathogenesis-related 1)的CRISPR/Cas9敲除突变体，也得到了类似结果[47]。证明SlMAPK3和SlNPR1响应干旱胁迫，赋予植株一定程度的抗旱能力，这些耐旱相关基因的编辑，凸显了基因组编辑技术在调节植株抗旱性中的可行性，但还未得到进一步应用。

植物激素对植物生长发育起着重要调节作用，其通过与外部环境之间相互作用提高植株对一定程度环境胁迫的适应能力[48]。油菜素甾醇(brassinosteroids，BRs)信号通路的重要转录因子BZR1(brassinazole resistant transcription factor 1)参与抗旱调节，CRISPR/Cas9诱变SlBZR1，突变体缺少热应激耐受性，且过氧化氢的含量减少、热胁迫耐受性降低[49]。证明SlBZR1是抗旱性正调控因子。氮响应负调控因子LBD(lateral organ boundaries domain)参与茉莉酸(jasmonate，JA)信号传导，CRISPR/Cas9介导的SlLBD40基因突变，提高了植株抗旱性，证明了SlLBD40是抗旱性的负调控因子[50]。最近一项研究利用CRISPR/Cas9技术编辑赤霉素受体蛋白基因GID1(gibberellin-insensitive dwarf1)，得到在缺水条件下保持较高水平叶片含水量的番茄植株，有效提高了番茄抗旱能力。在此基础上深入探究了赤霉素(gibberellin，GA)与番茄抗旱之间的关系，发现干旱胁迫下，植物体内GA水平降低，通过减少叶面积，促进气孔关闭，减少木质部增殖和扩张，以减少木质部水力传导等多种机制减少蒸腾作用，从而提高植株耐旱性[51]，但这些抗旱相关基因之间的关系还有待进一步研究。

2.2.2 提高抗寒性寒冷也是影响植物生长发育和产量的重要环境因素之一。CBFs(CRT binding factors)是一种存在于各物种中的冷响应因子，利用CRISPR/Cas9技术编辑SlCBF1基因得到的突变体对低温胁迫的耐受性和敏感度下降[52]，突变体脯氨酸含量、过氧化氢含量和抗氧化酶活性等生理指标测定也验证了这一结果，同时检测到JA、ABA等激素含量的提高。这些结果有助于更好地探究SlCBF1在抗冷机制中的作用方式。过表达光合碳同化关键酶SBPase能够提高植株耐寒性，而利用CRISPR/Cas9创建的突变体slsbpase则对冷害更加敏感，突变导致植株体内抗坏血酸和谷胱甘肽含量、谷胱甘肽合成酶活性及其编码基因转录丰度的降低，并抑制AsA-GSH再循环，这些结果支持SlSBPASE中的突变通过抑制 GSH 生物合成和 AsA-GSH 再循环来加剧低温诱导的氧化应激，并表明 SBPase 是番茄植株对低温胁迫的最佳响应所必需的[53]。

2.2.3 提高抗盐性盐碱胁迫会对农作物整个生长周期造成不同程度的抑制，限制农作物产量和质量。HyPRPs(hybrid proline-rich proteins)是盐胁迫反应的负调控因子，CRISPR/Cas9精确调控SlHyPRP1使番茄在萌发和营养阶段表现出高盐度耐受性[54]。SlHAK20(high-affinity K+20)位于4号染色体前端，具有钠钾离子转运体功能，能够维持植物组织中的K+和Na+稳态，利用CRISPR/Cas9进行敲除，发现该基因与番茄耐盐性相关，为解释耐盐分子机制以及耐盐品种的选育提供了重要依据[55]。

2.2.4 提高抗除草剂能力根寄生杂草对农作物产量和质量影响很大，MAX1(more axillary growth 1)基因是独脚金内酯(strigolactone，SL)合成基因，而SL是根寄生杂草萌发所必需的诱导剂。设计靶向SlMAX1基因第3个外显子的sgRNA，得到SlMAX1敲除突变体，发现该突变体SL水平降低，并获得对根寄生杂草分枝列当(Phelipancheaegyptiaca)的抗性，为有效控制根寄生杂草提供了新方法[56]。

2.2.5 提高多种非生物胁迫抗性植物通过活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除机制减轻非生物胁迫带来的损害，其稳态调节因子CGFS 型谷氧还蛋白(CGFS-type glutaredoxin，GRX)，CRISPR/Cas9靶向诱变分析番茄4种GRX基因(SlGRXS14、SlGRXS15、SlGRXS16和SlGRXS17)，其中SlGRXS14和SlGRXS17突变体对热、寒冷、干旱、重金属毒性、营养缺失和短光周期等非生物胁迫都更敏感，而SlGRXS16突变体主要对寒冷更加敏感，为通过基因工程方法提高番茄对多种非生物胁迫的耐受性提供了新思路[57]。

2.3 CRISPR/Cas9在提高番茄抗病性中的应用现状

近年来，番茄病害发生逐年增多，根据病原体可分为真菌病、病毒病和细菌病等，这些病害严重影响了番茄产量，CRISPR/Cas9系统的应用有效提高番茄对不同类型病原体的抵抗力。

2.3.1 提高真菌病抗性番茄白粉病主要危害叶片，该病害通过在叶片上形成霉斑来影响光合作用，直接影响植株生长发育。研究表明番茄Mlo(mildew resistance locus o)基因家族SlMlo1是白粉病易感基因，利用CRISPR/Cas9技术敲除SlMlo1，10个月内即可得到白粉病抗性很强的非转基因番茄[58]。在此基础上，研究人员引入多敲系统创制抗病突变体，构建双靶点CRISPR/Cas9系统靶向SlMlo1，成功获得SlMlo1大片段缺失且完全抗白粉病的突变体[59]。此外，白粉病易感基因PMR4(powdery mildew resistance 4)的缺失导致抗病性增强[60]，多靶点CRISPR/Cas9系统编辑SlPMR4的敲除突变体显著地提高了白粉病抗性。证明了CRISPR/Cas9基因组编辑技术能够快速且有效地提高植株对真菌病抗性。

致病疫霉(Phytophthorainfestans)所引起的的番茄晚疫病是一种严重的番茄真菌病害，主要影响设施番茄产量。miRNAs能够通过抑制其靶基因提高植物抗性，利用多重编辑系统同时敲除miR482b和miR482c，发现双突变体比单突变体抗性更高，揭示了miRNAs调控抗性新机制[61]。此外，CRISPR/Cas9验证了SlMYBS2对致病疫霉的正向调控作用，并推测SlMYBS2通过SA和JA信号通路抵抗致病疫霉[62-63]。CRISPR/Cas9技术还可用于更多番茄致病疫霉相关基因功能的进一步验证中。

基因组编辑技术还被应用于提高尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)所导致枯萎病[64]以及灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)所导致的灰霉病抗性[65]。CRISPR/Cas9编辑产生的Sloyc08g075770突变体对枯萎病敏感性更高[64]。此外，茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)在植物抗逆中起信号传递作用，研究人员推测MeJA相关转录因子MYC2(myelocytomatosis protein 2)参与调控植株抗逆，CRISPR/Cas9技术介导的SlMYC2突变，降低了突变体果实抗灰霉病能力和抗氧化酶活性，证明该基因在MeJA诱导的番茄果实抗灰霉病过程中起正调控作用[65]。此外，最近研究发现果胶裂解酶基因PL(pectate lyase)的CRISPR/Cas9敲除将植株对灰霉病的易感性降低了50%以上[66]。

2.3.2 提高病毒病抗性番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)是番茄生产中的一种毁灭性病害。CRISPR/Cas9能够靶向TYLCV基因组从而提高植物抗病性[67]，此外通过靶向番茄TYLCV基因组的复制酶Rep(replicase)及外壳蛋白CP(coat protein)，赋予突变体TYLCV抗性，其中CP位点的突变效率更高[68]。在此基础上利用诱导型启动子构建CRISPR/Cas9表达载体，靶向TYLCV的基因间区域IR(intergenic region)和CP序列，检测到病毒的积累减少或发生延迟[69]。除此之外，研究人员通过QTL定位(quantitative trait locus)鉴定了抗性连锁的一系列位点，使用CRISPR/Cas9敲除Ty-5位点编码的SlPelo(pelota)基因，其缺失也能有效抑制TYLCV病毒增殖[59]。

除直接干扰病毒基因组外，小型RNA在病毒防御中的作用也值得探讨。DCL(dicer-like)作为加工酶参与RNA沉默，其中拟南芥DCL2能够将内源性和病毒性dsRNA(double-stranded RNA)加工成22-nt的sRNA(small RNA)，从而造成病毒RNA沉默[70]。为了研究番茄DCL2在抗病中的功能，使用CRISPR/Cas9编辑番茄DCL2四个亚家族(SlDCL2a-SlDCL2d)中表达量最高的SlDCL2b，显著增强了番茄对番茄花叶病毒(tomato masaic virus，ToMV)的抗性[71]，同时编辑SlDCL2a和SlDCL2b则显著提高番茄对马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)的抗性[72]。研究认为SlDCL2是番茄抗病毒病途径中的关键组成部分，证明CRISPR/Cas9在创建番茄多重抗病品种方面有着很大的潜力。

2.3.3 提高细菌病抗性丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)是细菌性叶斑病的致病菌，它通过释放冠毒素COR(coronatine)引起植株气孔的张开，从而利于细菌的侵染。JAZ(jasmonate-ZIM)结构域蛋白是COR共受体，运用CRISPR/Cas9编辑SlJAZ2，使其缺少JAZ结构域，突变体对细菌性叶斑病产生抵抗力[73]。

黄单胞菌(Xanthomonaseuvesicatoriapv)引起番茄疮痂病，PUB(plant U-box)在多种作物中正向调控植株抗病性，CRISPR/Cas9敲除SlPUB24，突变体显示出黄单胞菌属T3族易感性，因此认为SlPUB24是一种黄单胞菌属T3族抗性基因，为抗疮痂病抗病机制研究提供基础[74]。此外，CRISPR/Cas9编辑抗性(resistance，R)基因Rx4，发现Rx4蛋白识别黄单胞菌属T3族病原体后，激活防御机制超敏反应(hypersensitive response，HR)，从而提高疮痂病抗性，亦为疮痂病抗病机制研究提供参考[75-76]。

2.3.4 提高植株多重抗病能力传统育种依赖于单一R基因，而易感基因S(Susceptibility gene)更具持久和广谱抗病性。CRISPR/Cas9技术提供了一种多重抗病材料的创建策略，其诱导的番茄S基因SlDMR6-1突变，赋予番茄更强的细菌、卵菌和真菌等不同类型的病原体抗性[77-78]。此外，CRISPR/Cas9诱导的乙炔酶编码基因ACER1a和ACET1b突变显示出对真菌和细菌病原体的抗性的增加[79]。

总而言之，这些研究结果体现了CRISPR/Cas9在抗病性方面的强大功能，该技术能够帮助科研人员探索病原体发病机制和植物体抗病机制，对农业可持续发展起到了很大的推动作用[80]。

3 CRISPR/Cas9系统存在的问题及改进方法

随着CRISPR/Cas9技术的不断发展，其应用范围的扩大也成了一个热点问题，CRISPR/Cas9系统编辑特异性的提高、转化系统的优化以及新型基因编辑系统的开发等方法能够降低CRISPR/Cas9技术应用的局限性。

3.1 编辑效率的提高

尽管CRISPR/Cas9具有精确高效的特点，但由于Cas9核酸酶在一定程度上可以容忍sgRNA与靶序列之间的错配，直接导致编辑精确性下降。虽然在植物中比较少见[81]，但研究人员还是开发了各种方法以降低脱靶效应。

稳定的sgRNA能够更准确地引导RNPs，Moreno-Mateos等[82]分析发现富含G而缺乏A的sgRNA更加稳定，设计sgRNA时应避开poly-T序列、限制GNGG序列，此外截短sgRNA也能降低脱靶效应[83]。此外，使用两种不同的Cas9酶进行编辑也能够极大地减少脱靶效应[84]。脱靶效应也与靶点序列设计相关，各种软件网站被开发以进行更具有特异性的靶点设计[82]。研究人员还开发出多靶点系统，通过串联sgRNA，靶向单个基因不同靶点，更彻底地进行基因编辑。此外，优化Cas9表达启动子[85]，诱导剂诱导HDR修复途径[86]，预测网站的应用[10]等也能提高基因编辑精确性。

3.2 转化系统的优化

目前，导入CRISPR系统比较成熟的方法是通过农杆菌介导的转化，该方法虽然能够使Cas9和sgRNA在植物体内稳定表达，但转化效率较低。Yu等[21]提出病毒介导的基因组编辑系统能够简化繁琐的转化过程，Ma等[87]将SpCas9和gRNA插入到SYNV病毒基因组中，成功应用于烟草，编辑效率能够达到40%～91%。CRISPR/Cas9的瞬时转化能够实现无转基因编辑，Yuan等[88]建立双生病毒复制子和双终止子的高水平瞬时转化系统，通过农杆菌侵染在番茄中瞬时表达，进行目标基因的编辑，该系统提高了编辑效率以及后代无Cas9植株的比例。此外，遗传转化过程中的生长条件改变也促进了突变的增加[3]。

3.3 新型基因编辑技术的发展

为了解决CRISPR/Cas9的限制性问题，新的基因编辑技术也在不断地被发现，如几乎没有脱靶效应的CRISPR/Cpf1[89]以及能够精准编辑的碱基编辑技术(base editing，BE)[90]等。

Zetsche等[91]发现Cpf1系统，将其归为CRISPR的第2类Ⅴ型，又被称为CRISPR/Cas12a。该系统使用单一RNA引导核酸内切酶，产生具有5′突出的粘性末端，促进NHEJ机制精确地编辑基因。此外该核酸酶本身是RNase能够切割RNA，且分子量小能够方便地进入细胞，扩大了CRISPR的应用范围[92]。此后还开发出了多种高效Cas12a[93]，以提高编辑效率，扩大PAM区域识别范围。CRISPR/LbCpf1的双生病毒多重复制子系统的使用成功编辑番茄耐盐相关的SlHKT1;2等位基因，且有效提高了HDR的基因组编辑效率，为无转基因编辑铺平道路[94]。Bernabé-Orts[95]证明了CRISPR/Cas12a能够在番茄中进行基因编辑，并且没有检测到脱靶效应，能够作为CRISPR/Cas9的替代工具，该系统还被应用于ToMV和番茄棕褐色果实病毒(tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV)的特异性检测[96]。

BE也在多种作物中得到了应用[97-98]，该技术基于CRISPR/Cas9系统，能够实现单个碱基替换。与CRISPR相比，BE不依赖于DSBs的产生，无需供体DNA参与并更具高效性和广泛适用性[90]。Shimatani等[99]将CRISPR/Cas9和活化诱导的胞苷脱氨酶AID(activation-induced cytidine deaminase)融合，将该系统命名为Target-AID，利用该系统进行编辑，得到的突变体在靶位点发生点突变，证明了BE在作物改良方面的可行性。乙酰乳酸合酶ALS(acetolactate synthase)赋予番茄对磺酰脲类除草剂氯磺隆抗性，且精确碱基编辑效率高达71%，其中12.9%的番茄植株无T-DNA插入[98]。在番茄中靶向类胡萝卜素代谢途径中的3个基因(SlDDB1、SlDET1和SlCYC-B)同时导入碱基置换突变，增加了番茄果实中类胡萝卜素含量，证明了Target-AID碱基编辑技术能够高效编辑多个基因[100]。Lu等[101]在番茄中利用Prime Editing技术实现了精准的碱基替换或删除，该团队引入荧光报告基因通过基因枪法进行转换，优化了植物密码子和启动子，从而大大提高编辑效率。

此外，更加高效的CRISPR/Cas12f1[102]以及TnpB[103]等系统也被开发。这些新型系统能够识别更多的PAM序列，结构更加简化，扩大了基因编辑的应用范围。通过基因编辑系统不断地更新，在番茄上使CRISPR系统成为一个常规化的技术将是一项长期持续的工作。

4 展 望

对植物活体基因组的定向编辑是长期以来农学上实现基因优化的重大难题，CRISPR/Cas9基因组编辑技术能够高效而简单地解决这一问题，使我们对基因功能的研究和农艺性状的优化有了一个不可替代的有力工具。一直以来转基因技术的应用都存在着很大的争议，但CRISPR/Cas9基因组编辑技术不引入外源基因，能够产生无T-DNA插入的编辑后代，这为使用生物技术手段创建优异的非转基因材料提供了崭新的途径。因此CRISPR/Cas9基因组编辑技术将在番茄等重要作物上获得广泛的应用。2016年4月，CRISPR/Cas9创建的蘑菇通过了美国农业部的认证，也让基因编辑在育种方面的应用受到了很大的鼓舞[104]，使得CRISPR/Cas9的道德讨论及法律制约也在不断完善。

目前基因编辑技术已经在抗病、抗逆方面以及改良农艺性状方面取得了很大的成就，加速了农作物的驯化，提高了番茄商业价值。与传统的基因沉默技术如RNAi及VIGS技术相比，CIRSPR/Cas9技术能够更加精确地对目标基因进行编辑，多敲系统的引入则能够更加彻底地对目标基因进行敲除。此外，CRISPR/Cas9技术创建的突变体能够稳定遗传，从而更准确地研究目标基因的功能，保证了科研的严谨性。尽管机遇与挑战并存，但CRISPR/Cas9的时代已经到来。