拮抗霍乱弧菌菌株枯草芽孢杆菌YB-99的筛选及在水产养殖中的应用

杨传伦，车树刚，张心青，陈振发，王建平，王秀芝

(黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东 滨州 256500)

0 引言

【研究意义】水产养殖中弧菌病是一种由弧菌引起的常见病害[1]，弧菌生命力强且繁殖速度快，营养需求低，一旦养殖水体中弧菌数量未得到有效控制，弧菌会爆发性繁殖，导致水体恶化[2-3]。水产动物由于环境改变将导致机体免疫减弱，弧菌乘势入侵，出现白便、偷死、溃烂、发育异常等症状[4-5]。若不及时控制水体中的弧菌，一旦爆发后果将难以预测，轻者会导致大量养殖体死亡[6]，重者将面临绝产[7]。因此，开展弧菌病防治研究，对促进水产养殖的绿色生态持续发展具有重要意义。【前人研究进展】导致弧菌病的病原菌主要包括鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)等[8-9]。目前水产养殖业中弧菌病防治的主要手段仍为化学方法[10]，如抗生素与消毒剂的交替使用[11]，然而养殖过程中抗生素等化学药剂的重复、大量使用势必会提高弧菌的耐药性与抗药性，同时化学药剂对养殖水体的污染是不可逆的[12]，更不会被水体降解，长期食用这些被化学药剂污染的产品对人体也是百害而无利[13-14]。因此，亟需寻找能够高效抑制水体中弧菌繁殖的且不会对水体环境造成破坏的产品或技术为水产养殖保驾护航。【研究切入点】近年来，益生菌在水产养殖中的应用研究备受关注，益生菌对水产养殖的益处是多方位的，多集中于净化水体、促进养殖体生长、通过分泌小分子物质提高动物体免疫力及对水体中病原菌的竞争性抑制等，甄晓然等[15-16]筛选出对副溶血性弧菌具有拮抗作用的弧菌，拮抗效果达90%，但未进行应用效果评价，而且多数学者主要是针对海水养殖中的弧菌进行研究，鲜有对淡水养殖尤其是霍乱弧菌拮抗方面的研究报道[17-18]。目前，主要应用于水产养殖的微生物菌剂包括酵母菌(Yeast)、乳酸菌(Lacticacidbacteria)及芽孢杆菌(Bacillus)等[19]，由于芽孢杆菌抗逆性强、易保存、可以分泌多种不同结构的活性物质等特点，在微生态领域受到广泛关注。【拟解决的关键问题】黄河三角洲京博化工研究院研究团队多次对山东乔庄水产养殖基地取样分析，发现养殖水体中的弧菌多为霍乱弧菌，因此以实验室分离的霍乱弧菌为研究对象，以乔庄养殖户中广泛好评的弧菌清药剂为对照，筛选分离对霍乱弧菌具有拮抗效果的菌株，从拮抗株中筛选得到效果最优的菌株并将其应用于南美白对虾养殖中，考察拮抗菌株对水产养殖池水体霍乱弧菌的拮抗效果，为水产养殖中弧菌病生物防治提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株及水产动物 病原菌菌株霍乱弧菌(V.cholerae)为黄河三角洲京博化工研究院实验室菌种库保存，分离自山东乔庄水产养殖基地；拮抗菌株为实验室菌种库保存的120株芽孢杆菌类菌株，依次命名为YB-1至YB-120；试验水产动物为南美白对虾，虾苗规格0.62 g/尾。

1.1.2 试剂及培养基 MRS培养基(g/L)：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，柠檬酸三铵2 g，葡萄糖20 g，硫酸锰0.25 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.58 g，磷酸氢二钾2 g，吐温-80 1 mL，琼脂20 g，蒸馏水，pH6.2～6.4；LB培养基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水，pH7.2～7.4；YPD培养基(g/L)：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母粉10 g，蒸馏水，pH自然；TCBS培养基(g/L)：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，硫代硫酸钠10 g，枸橼酸钠10 g，牛胆粉5 g，牛胆酸钠3 g，蔗糖20 g，氯化钠10 g，柠檬酸铁1 g，溴麝香草酚兰0.04 g，麝香草酚兰0.04 g，琼脂15 g，pH 8.5～8.7；弧菌清(100 g/瓶，是防治霍乱弧菌的常用药剂),购买自上海西格生物科技有限公司。

1.1.3 试验器材 恒温振荡器SHY-2(THZ-82),常州中捷精密机械有限公司；生化培养箱BJPX,山东博科生物产业有限公司；电子天平FB124，上海齐强仪器制造有限公司；灭菌锅YXQ-75G，上海博迅实业有限公司；超净工作台VS-840，苏州尚田洁净技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌株的筛选

1)拮抗菌株初筛。采用滤纸片法[20]，分别将活化后的病原菌(霍乱弧菌)和拮抗菌株接种入新鲜的无菌LB液体培养基中，培养过夜，取100 μL指示菌涂布于新鲜的TCBS固体培养基中，用无菌打孔器在涂过指示菌的平板上等距离打2个直径10 mm已灭菌孔，取10 μL待测菌液滴于孔内，同时设置弧菌清药剂(稀释1 000倍后取10 μL滴于孔内)作为对照，然后35℃培养箱中培养过夜，24 h左右观察孔周围是否出现抑菌圈并测量其直径，初步筛选拮抗菌株。

2)拮抗菌株复筛。采用共培养法[20]，分别刮取活化后的拮抗菌株和霍乱弧菌接种到LB液体培养基中培养过夜，分别吸取200 μL霍乱弧菌和拮抗菌菌液接入同一个装有100 mL稀释5倍的液体LB培养基的锥形瓶内共培养，以未接种拮抗菌株的LB液体培养基为对照，37℃、150 r/min培养过夜，16 h后采用10倍递增稀释法稀释，选择合适浓度(平板上菌落数30～300个为宜)涂布于新鲜的 TCBS固体培养基中，放入恒温生化培养箱培养24 h，考察拮抗菌株对霍乱弧菌的拮抗率，筛选最优拮抗菌株。

1.2.2 拮抗菌株对霍乱弧菌的拮抗试验

1)实验室接种试验。4℃冰箱中取出拮抗菌株平板，在超净工作台用无菌的接种环小心挑取平板上的单菌落接种于100 mL无菌LB液体培养基中，37℃、180 r/min震荡培养24 h。于500 mL锥形瓶中加入100 mL乔庄南美白对虾养殖水。取25 mL培养完成的拮抗株发酵液，4 500 r/min离心5 min，倒掉上清液，将离心后的菌体接入养殖水中(处理组)，同时以未接种拮抗菌的为对照组，每组2个重复，37℃、150 r/min振荡培养，每天取样检测弧菌变化，连续检测3 d，即在培养24 h、48 h和72 h时考察霍乱弧菌的菌量及其拮抗菌株对霍乱弧菌的拮抗率。

2)南美白对虾养殖池应用试验。2020年7—9月,在山东乔庄某农户的室外南美白对虾养殖池开展拮抗菌株对霍乱弧菌的拮抗试验。养殖池面积1 000 m2，投殖密度约53尾/m2，虾苗投放15 d后开始投加菌剂。4℃冰箱中取出拮抗菌株平板，在超净工作台用无菌接种环挑取平板上的单菌落接种于100 mL无菌LB液体培养基中，37℃、180 r/min震荡培养16 h后转接入1 L无菌LB液体培养基中，37℃、180 r/min震荡培养24 h，按照此方法制备10 L拮抗菌株发酵液待用。取10 L培养完成的拮抗菌株发酵液，4 500 r/min离心5 min，倒掉上清液，离心后的菌体接入其中1个养殖池中(处理组)，同时以施用弧菌清药剂处理的为对照组。试验开始后每隔15 d取样1次，连续取样5次，按照平板涂布方式检测水体中弧菌菌量。养殖池出虾时进行虾重、成活率等生物量的检测。

1.3 数据统计分析

采用Excel、Microsoft PowerPoint和SPSS等进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗霍乱弧菌的枯草芽孢杆菌YB-99的获得

初筛选结果表明，在120株芽孢杆菌中，YB-9、YB-45、YB-95、YB-95、YB-96、YB-99、YB-119菌株对霍乱弧菌的抑菌圈直径极显著大于对照药剂(弧菌清)，其中以菌株YB-99的抑菌圈直径最大，达2.20 cm。因此，初步判断该6株菌株对霍乱弧菌具有拮抗效果。对初筛获得的6株拮抗菌株进行共培养复筛，结果(表1)表明，对霍乱弧菌拮抗率最高的菌株为YB-99，拮抗率达96.80%。复筛与初筛结果高度吻合，因此选取菌株YB-99为霍乱弧菌拮抗菌株。

表1 6 株弧菌拮抗菌株对霍乱弧菌的拮抗率Table 1 The antagonistic rate of 6 strains against V. cholerae

2.2 枯草芽孢杆菌YB-99对霍乱弧菌的拮抗率

从表2看出，在实验室接种试验中，接种拮抗菌株YB-99的处理连续3 d即接种72 h内对霍乱弧菌的拮抗率都保持90%以上，且随接种时间推延拮抗率呈上升趋势。另外，同一考察时间，空白对照的弧菌菌量远高于接种拮抗菌株YB-99的处理，说明菌株YB-99在短时间内可有效抑制弧菌的快速繁殖。

表2 不同接种时间枯草芽孢杆菌YB-99对霍乱弧菌的拮抗率Table 2 The antagonistic rate of B. subtilis YB-99 against V. cholerae with different inoculation time

2.3 枯草芽孢杆菌YB-99在南美白对虾养殖池的应用效果

2.3.1 抑制弧菌繁殖 从图1可知，添加枯草芽孢杆菌YB-99的处理养殖池中霍乱弧菌菌量随养殖时间延长略有增加，但变幅不大，一直保持在安全限值(小于103cfu/mL)[21]以内，处理75 d时霍乱弧菌菌量为4.01×102cfu/mL。对照组(施用弧菌清)的弧菌菌量随养殖时间延长呈上升趋势，处理45 d时弧菌菌量由初始的1.55×102cfu/mL升至1.97×103cfu/mL，已超出安全限值；处理75 d时弧菌菌量升高至8.84×103cfu/mL。表明，枯草芽孢杆菌YB-99对弧菌繁殖具有抑制作用，其抑制效果明显优于对照药剂弧菌清。

图1 不同处理养殖池霍乱弧菌的菌量Fig.1 The number of V. cholerae with different treatments

2.3.2 促进南美白对虾生长 从表3看出，不同抑菌处理养殖池南美白对虾的生长存在较大差异。添加枯草芽孢杆菌YB-99处理的对虾成活率为92.81%，虾重为21.74 g/尾，池塘出虾量1 372 kg，3项指标均明显高于对照组(施用弧菌清)，原因是对照组池塘的弧菌量超限，对南美白对虾的养殖造成一定负面影响。说明，枯草芽孢杆菌YB-99对霍乱弧菌的拮抗效果优于药剂弧菌清，施用枯草芽孢杆菌YB-99后可促进对虾健康安全生长。

表3 不同抑菌处理养殖池南美白对虾的生长情况Table 3 Growth status of P. vannamei cultured under different antimicrobial treatments

3 讨论

随着对虾养殖业的快速发展，逐渐成为我国水产养殖的支柱[21]，由于对虾对水体及环境的敏感性，弧菌病等爆发性流行疾病对对虾养殖是致命性打击，然而近年来抗生素类药剂泛滥使用使水体中病原菌产生抗药性，且对水体环境造成不可逆的污染，寻求安全高效的弧菌病防治技术是对虾养殖业多年来的关注焦点。生物拮抗技术以调节水体微生态环境为手段达到水体净化的效果[22]，对水环境及养殖体不会产生二次污染，而且在增强动物体免疫力及生长方面效果显著，因此该技术近年来得到广泛应用。

生物拮抗技术的关键是高效拮抗株的筛选，黄河三角洲京博化工研究院从菌株的安全性及应用现场水体环境出发，以实验室菌种库中保存的120株芽孢杆菌为筛选对象进行试验，分别通过初筛与复筛确定高效拮抗株，通过微生态技术实现养殖水体中霍乱弧菌的高效拮抗，不但保护了水产养殖体免受弧菌的危害，而且对养殖环境不会产生破坏，是一种可持续低成本的养殖方法，具有化学方法所无法比拟的优势。

4 结论

黄河三角洲京博化工研究院实验室通过初筛与复筛获得高效拮抗霍乱弧菌的枯草芽孢杆菌YB-99，将其应用于南美白对虾养殖中，能够抑制霍乱弧菌的繁殖，施用枯草芽孢杆菌YB-99处理75 d时养殖池的霍乱弧菌菌量为4.01×102cfu/mL，在弧菌菌量安全限值(小于103cfu/mL)以内；而弧菌清对照组处理45 d时养殖池的弧菌菌量达1.97×103cfu/mL，已超出安全限值；处理75 d时弧菌菌量升高至8.84×103cfu/mL。说明养殖池中施用枯草芽孢杆菌YB-99可有效抑制弧菌繁殖。

施用拮抗菌枯草芽孢杆菌YB-99的养殖池南美白对虾成活率达92.81%，较弧菌清对照组提高9.1%；出虾时虾重为21.74 g/尾，较对照组提高13.04%；施用YB-99菌组的南美白对虾收益较对照组提高18.38%。总体看，枯草芽孢杆菌YB-99抑制养殖池中弧菌生长，保护虾体免受弧菌侵染，从而提高对虾的成活率与收益。