小麦赤霉病禾谷镰孢菌生物基增效剂的筛选

张 盈，黄文源，魏 进，龙家寰，高 迪，段婷婷

(贵州省植物保护研究所，贵州 贵阳 550006)

0 引言

【研究意义】普通小麦(TriticumaestivumL.)是世界上最重要的粮食作物之一，具有较高的营养价值和经济价值，养育了世界上约1/3的人口[1]。小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)由禾谷镰刀菌、亚洲镰刀菌、雪腐镰刀菌、梨孢镰刀菌、黄色镰刀菌、燕麦镰刀菌和串珠镰刀菌等引起，病菌侵染后主要引起茎基腐、苗枯、秆腐和穗腐[2-3]，是危害小麦最严重的病害之一，国内生产上造成的产量损失一般为17.17%，轻发年份造成的损失为10万t，重发流行年份造成的损失达200余万t，大流行年份可导致部分田块绝收[4-5]。目前，小麦赤霉病主要依赖于化学药剂防治，而药剂品种相对较为单一，且随着其长期使用，靶标菌产生了极严重的抗药性。因此，研究开发新药剂品种应用于生产防治具有重要意义[6]。【前人研究进展】戊唑醇(Tebuconazole)属三唑类，是C-14-脱甲基酶抑制剂，抑制真菌细胞膜麦角甾醇的生物合成，对小麦赤霉病有较高的防效[7-8]。丙硫唑(Albendazole)和多菌灵(Carbendazim)均属苯并咪唑类杀菌剂，作用于赤霉病病菌的β-微管蛋白，抑制细胞的有丝分裂[9]。多菌灵对小麦赤霉病防效较高，是最早防治赤霉病的传统药剂，农户认可度高且成本低；丙硫唑又称丙硫多菌灵，2016年开始登记用于防控赤霉病[10]，效果较好，且由于使用时间较短，较少产生抗性问题。【研究切入点】目前，赤霉病抗性广泛发生，如在江苏、安徽和河南等地检测到对多菌灵的抗性频率为58.8%、37.7%和4.8%，在江苏和安徽的抗药程度达危险水平；在山西、江苏、安徽、山东、河南、湖北和陕西等7个省均检测到抗戊唑醇的抗性菌株，抗性频率1.2%～6.1%[11]。抗性的产生和增大必然引起农药的超标使用甚至滥用，加快抗性增长，造成农业环境污染的同时也带来农产品质量安全风险问题。新农药的开发难度大、时间长，农药轮换使用和农药复配则成为目前病害抗性治理的常规手段。【拟解决的关键问题】选择小麦赤霉病防控效果较好的戊唑醇、丙硫唑和多菌灵3种化学农药与苦参、黄岑片和丹参等9种中药提取物进行复配，探明其对小麦赤霉病的防控效果并筛选出中药提取物抑菌活性较好的生物基增效剂，以期为小麦赤霉病防控上抑菌活性较好的生物基增效剂的选择提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌 小麦赤霉病禾谷镰孢菌(FusariumgraminarumSchw)，由贵州大学农学院农安实验室提供。

1.1.2 药剂 98%多菌灵原药、95%戊唑醇原药和98%丙硫唑原药，均由贵州道元生物技术有限公司提供。

1.1.3 培养基 供试培养基为PDA培养基，参照文献[8]的方法组配配方：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、纯净水1 000 mL；煮好后在121℃条件下灭菌20 min，冷却至50℃左右备用。

1.1.4 中药材 苦参、黄岑片、丹参、川银花、干鱼腥、马齿苋、黄连片、五倍子和野菊花共计9种，市购。

1.1.5 仪器设备 HIRAYAMA-50灭菌器(日本Hirayama)、SJ-CJ-2FD超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司生产)、BIC-400人工气候箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产)、RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂生产)、10 mL离心管、移液枪、10 mL量杯、9 mm培养皿等。

1.2 方法

1.2.1 中药提取物的制备 将中药研磨成粉，用无水乙醇浸泡7 d后过滤，用旋转蒸发仪蒸发，直到没有乙醇蒸出；取出，4℃密封保存备用。

1.2.2 9种中药提取物对小麦赤霉菌丝生长的抑制效果 在灭菌培养皿中倒入9 mL PDA培养基和1 mL药剂稀释液，充分摇匀，制成系列浓度梯度的含药培养基平板。用打孔器取已活化的病菌菌饼，菌丝面朝下接种于含药培养基平板中央，以不含药培养基平板接菌为对照，3次重复，置于28℃恒温培养箱内培养。待对照培养基上菌落直径约为培养皿直径的80%时，测量不同处理的菌落直径，计算抑制率。

1.2.3 中药提取物与化学杀菌剂复配对小麦赤霉病菌的毒力测定 选择9种中药提取物中对小麦赤霉病菌丝生长抑制效果相对较好的中药提取物与3种化学农药进行复配试验。化学农药与中药提取物按有效成分1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的比例复配，再按1.2.2 的方法进行试验，根据菌丝生长抑制率求出毒力回归方程，计算各药剂对小麦赤霉病的抑制中浓度EC50，得出不同配比对小麦赤霉病的毒力，并计算共毒系数(CTC)，评价药剂混用的效果。CTC≤80为拮抗作用，80

单剂毒力指数=(标准药剂EC50/供试单剂EC50)×100

CTC=(ATI/TTI)×100

ATI=(标准药剂EC50/供试混剂EC50)×100

TTI=药剂A的毒力指数×混剂中A药剂的百分含量+药剂B的毒力指数×混剂中B药剂的百分含量

式中，ATI为混剂实测毒力指数，TTI为混剂理论毒力指数。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 2010处理数据，DPS 7.05 对数据进行单因素方差分析，邓肯氏新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 9种中药提取物对小麦赤霉病菌丝生长的抑制率

从表1看出，不同浓度中药提取物对小麦赤霉菌丝生长的抑制效果存在差异。浓度为10 μg/mL时，对小麦赤霉病菌丝生长的抑菌率为-33.95%～-7.89%，均<0，表明，9种中药提取物低浓度下对小麦赤霉菌丝生长具有促进作用。浓度为100 μg/mL时，对小麦赤霉病菌丝生长的抑菌率为-17.0%～31.66%，其中，黄岑片、黄连片、丹参和苦参4种中药提取物的抑菌效果相对较好，分别为18.31%、20.65%、27.56%和31.66%。浓度为1 000 μg/mL时，除五倍子提取物的抑菌率为95.82%外，其余植物提取物的抑制率均达100%。综合看，黄岑片、黄连片、丹参和苦参4种中药提取物对小麦赤霉病菌丝生长的抑菌效果最好。因此，选择这4种中药提取物与3种化学农药进行后续复配试验。

表1 9种中药提取物对小麦赤霉病菌丝的抑制率 Table 1 Inhibition rate of 9 traditional Chinese medicine extracts against F. graminarum of wheat scab

2.2 中药提取物及化学杀菌剂对小麦赤霉病菌的敏感性

从表2看出，4种中药提取物及3种化学杀菌剂对小麦赤霉病菌的毒力存在差异。中药提取物：黄岑片、苦参、丹参和黄连片的毒力回归方程分别为yhc=0.917 5+1.697 3x、yk=1.622 7+2.139 6x、yds=0.515 3+0.612 5x和yhl=0.108 2+2.761 0x，对小麦赤霉病菌菌丝的EC50为37.89～61.42 μg/mL。化学杀菌剂：戊唑醇、丙硫唑和多菌灵的毒力回归方程分别为yw=5.170 6+1.446 9x、yb=4.001 0+1.697 3x和ydj=5.118 7+4.016 5x，对小麦赤霉病菌菌丝的EC50为0.76～3.88 μg/mL。

表2 4种中药提取物及3种化学杀菌剂对小麦赤霉病菌的敏感性Table 2 Sensitivity of four traditional Chinese medicine extracts and three chemical fungicides against Fusarium graminarum of wheat scab

2.3 戊唑醇与4种中药提取物复配对小麦赤霉病菌的毒力

从表3可知，戊唑醇与黄岑片提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为2.14～47.88 μg/mL，以1∶1最小，为2.14 μg/mL，1∶40最大，为47.88 μg/mL；共毒系数为36.43～70.16，均<80，呈拮抗作用。戊唑醇与苦参提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为1.94～29.40 μg/mL，以1∶1最小，为1.94 μg/mL，1∶40最大，为29.40 μg/mL；共毒系数为58.81～79.22，均<80，呈拮抗作用。戊唑醇与丹参提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为2.20～24.62 μg/mL，以1∶1最小，为2.20 μg/mL，1∶40最大，为24.62 μg/mL；共毒系数为68.10～79.91，均<80，呈拮抗作用。戊唑醇与黄连片提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为1.99～23.39 μg/mL，以1∶1最小，为1.99 μg/mL，1∶40最大，为23.39 μg/mL；共毒系数为59.92～87.98，除1∶40(87.98)>80呈相加作用外，其余复配比例均<80，呈拮抗作用。

表3 戊唑醇与植物提取物复配对小麦赤霉病菌的毒力Table 3 Virulence of tebuconazole compounded with 4 Chinese traditional medicine extracts against F. graminarum of wheat scab

2.4 丙硫唑与4种中药提取物复配对小麦赤霉病菌的毒力

从表4可知，丙硫唑与黄岑片提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为12.01～52.13 μg/mL，以1∶1最小，为12.01 μg/mL，1∶40最大，为52.13 μg/mL；共毒系数为60.77～89.98，其中1∶5(88.68)和1∶40(89.98)均>80，呈相加作用，其余复配比例均<80，呈拮抗作用。丙硫唑与苦参提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为7.38～48.62 μg/mL，以1∶1最小，为7.38 μg/mL，1∶40最大，为48.62 μg/mL；共毒系数为64.20～95.38，除1∶1>80(95.38)呈相加作用外，其余复配比例均<80，呈拮抗作用。丙硫唑与丹参提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为13.67～52.41 μg/mL，以1∶1最小，为13.67 μg/mL，1∶40最大，为52.41 μg/mL；共毒系数为48.26～77.06，均<80，呈拮抗作用。丙硫唑与黄连片提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为12.72～47.94 μg/mL，以1∶1最小，为12.72 μg/mL，1∶20最大，为47.94 μg/mL；共毒系数为57.25～97.17，除1∶40(97.17)>80呈相加作用外，其余复配比例均<80，呈拮抗作用。

表4 丙硫唑与植物提取物复配对小麦赤霉病菌的毒力Table 4 Virulence of albendazole compounded with 4 Chinese traditional medicine extracts against F. graminarum of wheat scab

2.5 多菌灵与4种中药提取物复配对小麦赤霉病菌的毒力

从表5看出，多菌灵与黄岑片提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为2.09～26.83 μg/mL，以1∶1最小，为2.09 μg/mL，1∶40最大，为26.89 μg/mL；共毒系数为76.46～88.51，其中1∶1(87.67)和1∶40(88.51)均>80，呈相加作用，其余复配比例均<80，呈拮抗作用。多菌灵与苦参提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为2.04～30.96 μg/mL，以1∶1最小，为2.04 μg/mL，1∶40最大，为30.96 μg/mL；共毒系数为62.15～96.88，1∶1(88.99)和1∶5(96.88)均>80，呈相加作用外，其余复配比例均<80，呈拮抗作用。多菌灵与丹参提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为3.32～37.81 μg/mL，以1∶1最小，为3.32 μg/mL，1∶40最大，为37.81 μg/mL；共毒系数为55.04～74.89，均小于80，呈拮抗作用。多菌灵与黄连片提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50为2.20～36.76 μg/mL，以1∶1最小，为2.20 μg/mL，1∶40最大，为36.76 μg/mL；共毒系数为63.67～83.57，其中，1∶1(83.24)、1∶5(83.57)和1∶20(81.22)均>80，呈相加作用，其余复配比例均<80，呈拮抗作用。

表5 多菌灵与植物提取物复配对小麦赤霉的协同作用Table 5 Virulence of carbendazim compounded with 4 Chinese traditional medicine extracts against Fusarium graminaru of wheat scab

3 讨论

纪明山等[12]研究表明，丹参等20种中药对小麦赤霉病有不同程度的抑制作用。赵恭文等[13]发现，黄岑等16种中草药提取物对禾谷镰孢菌等植物病原真菌有一定的抑制效果。杨阿丽等[14]研究发现，苦参碱等生物药剂与戊唑醇等化学农药组合使用可明显提高病原菌的抑制率，可作为高效、低毒的混合型药剂应用于实际生产中。研究结果表明，不同浓度中药提取物对小麦赤霉病菌菌丝生长的抑制效果存在差异性，浓度为10 μg/mL和100 μg/mL时，对小麦赤霉病菌丝生长的抑菌率分别为-33.95%～-7.89%和-17.0%～31.66%，1 000 μg/mL时，除五倍子提取物的抑菌率为95.82%外，其余植物提取物的抑制率均达100%。戊唑醇、丙硫唑和多菌灵与黄岑片提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的EC50分别为2.14～47.88 μg/mL、12.01～52.13 μg/mL和2.09～26.83 μg/mL，与苦参提取物复配的EC50分别为1.94～29.40 μg/mL、7.38～48.62 μg/mL和2.04～30.96 μg/mL，与丹参提取物复配的EC50分别为2.20～24.62 μg/mL、13.67～52.41 μg/mL和3.32～37.81 μg/mL，与黄连片提取物复配的EC50为1.99～23.39 μg/mL、12.72～47.94 μg/mL和2.20～36.76 μg/mL。戊唑醇、丙硫唑和多菌灵与黄岑片提取物不同复配比例对小麦赤霉病菌的共毒系数分别为36.43～70.16、60.77～89.98和76.46～88.51，与苦参提取物复配的共毒系数分别为58.81～79.22、62.15～96.88和62.15～96.88，与丹参提取物复配的共毒系数分别为68.10～79.91、48.26～77.06和55.04～74.89，与黄连片提取物复配的共毒系数分别为59.92～87.98、57.25～97.17和63.67～83.57。其中，戊唑醇与黄连片提取物复配除1∶40对小麦赤霉病菌的作用效果呈相加作用，与其余复配比例以及其余中药提取物各复配比例均呈拮抗作用；丙硫唑与黄岑片提取物复配比例为1∶5和1∶40、与苦参提取物复配比例为1∶1、与黄连片提取物复配比例为1∶40时对小麦赤霉病菌的作用效果为相加作用，与其余复配比例以及其余中药提取物各复配比例均呈拮抗作用；多菌灵与黄岑片提取物复配比例为1∶1和1∶40、与苦参提取物复配比例为1∶1和1∶5、与黄连片提取物复配比例为1∶1和1∶5对小麦赤霉病菌的作用效果为相加作用，与其余复配比例以及其余中药提取物各复配比例均呈拮抗作用，研究结果与前人报道结论相近。研究仅进行了室内抑菌活性测定，中药提取物作为助剂在田间使用表现有待进一步试验验证，且小麦赤霉病由多种镰刀菌引起，黄岑片、苦参、丹参和黄连片提取物对其他小麦赤霉病菌的毒力作用仍需进一步深入研究。

4 结论

黄岑片、黄连片、丹参和苦参4种中药提取物作为戊唑醇、丙硫唑和多菌灵的增效助剂时各比例EC50分别为1.94～47.88 mg/L、7.38～52.41 mg/L和2.04～37.81 mg/L。