高效液相色谱-串联质谱法测定配合饲料中的洛克沙胂

郑胜兰 耿士伟 贾书静 尹原妍 吴琼

(江苏省畜产品质量检验测试中心，江苏 南京 210036)

洛克沙胂是一种易溶于极性有机溶剂和碱性溶液的有机砷制剂，用于猪和鸡的促生长。其可增强机体同化作用，促进蛋白质合成，增强骨髓的造血机能，改善皮肤营养，改善胴体品质，提高饲料报酬[1-3]。经过动物代谢，洛克沙胂大多数仍会以洛克沙胂的形式排出体外，但是研究表明,在微生物、矿物和光解等条件作用下，洛克沙胂会转化成无机砷，造成环境二次污染[4-10]。为保障动物产品质量安全，维护公共卫生安全和生态安全,2018年1月发布农业部第2638号公告，禁止在食品动物中使用洛克沙胂。

洛克沙胂的禁用对饲料中洛克沙胂的检测灵敏度有了更高的要求。目前，饲料中洛克沙胂的检测遵循的是禁令颁布前的国标《GB/T 22146-2008饲料中洛克沙胂的测定高效液相色谱法》，该检测方法为高效液相法，方法的定量限为5mg·kg-1。显然，该标准已无法适应当前检验的需求，亟需建立一个灵敏度更高，检出限更低的方法。文献报道的洛克沙胂的测定方法有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、高效液相色谱-电感耦合等离子体-串联质谱法等[11-13]。因此，本文以配合饲料为研究对象，建立了洛克沙胂的高效液相-串联质谱法，并且针对样品的前处理方法进行了较深入的研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇(色谱纯，德国默克公司)；乙腈(色谱纯，德国默克公司)；甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲酸(色谱纯，美国ACS公司)；氨水(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；洛克沙胂标准品(98.5%，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)。

1.2 仪器与设备

液相色谱-串联质谱仪(配备电喷雾离子源，美国ThermoFisher公司)；MAX固相萃取小柱(150mg·6mL-1，美国Waters公司)；振荡器(德国IKA公司)；微孔滤膜(0.22μm，美国PALL公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 样品提取

称取试样2g(精确至0.01g)，置于50mL离心管中，准确加入20.00mL甲醇，振荡提取20min，10000r·min-1离心10min，取上清液5.00mL于试管中，加入0.5mL氨水，混匀备用。

1.3.2 样品净化

固相萃取小柱用5mL甲醇活化，取备用液过柱，依次用5mL水和5mL甲醇淋洗，抽干。用15%甲酸甲醇溶液5mL洗脱，收集洗脱液，于60℃水浴下氮吹至干，0.1%甲酸-甲醇水溶液2.00mL溶解，混匀,0.22μm滤膜过滤后上机测试。

1.3.3 基质匹配标准系列曲线的制备

称取洛克沙胂标准品50mg(精确至0.01mg)，用甲醇溶解定容于50mL容量瓶中得1mg·mL-1的标准储备液，再以含有0.1%甲酸的10%甲醇溶液稀释定容配制系列标准溶液，浓度分别为5ng·mL-1、10ng·mL-1、25ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1。称取同类基质的空白样品6份，按1.3.1步骤处理至氮吹至干，分别加入2.00mL上述标准系列工作溶液，混匀，制得理论浓度为5ng·mL-1、10ng·mL-1、25ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1的基质匹配标准系列溶液，过膜后上机测试。在优化的色谱条件下进行测定，以洛克沙胂的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 液相色谱参考条件

色谱柱：C18柱,3.0mm×150mm，粒径1.8μm，或性能相当者；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相：A相为0.1%甲酸溶液，B相为乙腈，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.5 质谱参考条件

电离方式：电喷雾电离；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测；毛细管电压、碰撞能量等参数应优化至最佳灵敏度；定性离子对、定量离子对及碰撞能量参考值见表2。

表2 洛克沙胂的定性离子对、定量离子对及碰撞能量参考值

1.3.6 检出限和定量限

选取空白基质，向其中加入一定浓度的洛克沙胂对照品，按照优化后的方法进行测定，依据信噪比(s/n)≥3及信噪比(s/n)≥10的原则，确定本方法的检出限和定量限。

1.3.7 方法回收率测定

称取不同基质的试样2g(精确至0.01g)，置于50mL离心管中，加入洛克沙胂标准溶液，使洛克沙胂在饲料中的添加量为0.05mg·kg-1、0.2mg·kg-1和0.5mg·kg-1，按样品前处理方法处理样品后上机测定。以洛克沙胂的色谱峰面积代入回归方程计算方法回收率。

1.3.8 精密度测定

样品处理及测定方法同1.3，每个添加水平作6份平行测定，求得日内标准偏差；选取洛克沙胂添加水平为0.2mg·kg-1的加标样，连续测定3d，求得日间标准偏差。

2 结果与分析

2.1 流动相的考察与确定

实验对流动相进行考察，当使用甲醇作为流动相时，在相同的条件下，离子化将受到不同程度的抑制，响应值将会明显的降低，导致了灵敏度的下降，而使用乙腈作为流动相时，离子化效率明显是要优于甲醇，所以本实验采用乙腈作为流动相中的有机相。在流动相中加入甲酸能够明显地增加化合物在ESI-模式下的离子化效率。考虑到上样溶液的有机相比例，起始流动相设为5%甲醇溶液(含0.1%甲酸)，考虑到饲料样品基质较复杂，实验选择梯度洗脱程序，洗脱程序见表3。

表3 液相梯度洗脱程序

参考优化后的流动相，确定液相条件为色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径3.0mm，粒径1.8μm或者性能相当；柱温：30℃；流动相：A相为0.1%甲酸溶液，B相为乙腈；流速：0.3mL·min-1；进样量：10μL。典型色谱图见图1。

2.2 监测离子对的选择及质谱条件优化

将100ng·mL-1的洛克沙胂标准溶液在质谱ESI-上扫描，选出信号相对较强的2个碎片离子与其母离子分别组成2对监测离子对，其中需要注意的是尽可能避免选择与分子离子峰质量数相差18的脱水碎片离子。在SRM模式下，实施对于透镜电压与碰撞能量等参数的进一步优化。优化过后得到的特征离子对和质谱条件如表4所示，其定性分析标准为保留时间和选择离子的丰度比，使得这个方法拥有更强的专属性，并且有效地避免了来自杂质的干扰。

质谱条件：离子源为电喷雾电离；扫描方式为负离子模式；检测方式为多反应监测。洛克沙胂的特征离子对及碰撞能量见表4。

表4 洛克沙胂的定性离子对、定量离子对及碰撞能量参考值

图1 基于C18色谱柱的MRM色谱图

2.3 提取剂的选择

由于洛克沙胂易溶于甲醇和稀碱，在水中略溶解。通过实验结果并参考相关文献，选取甲醇、5%氨水甲醇、50%甲醇、10%甲醇、20g·L-1磷酸氢二钾溶液共5种提取液，其中20g·L-1磷酸氢二钾溶液为国家标准《饲料中洛克沙胂的测定高效液相色谱法》中的提取液。在0.2mg·kg-1的添加水平下加入20mL提取液考察实际样品中目标物的提取效率，结果如表5所示。

表5 不同提取剂提取效率考察表(n=5)

由表5可知，3种配合饲料在5种提取溶剂条件下，提取效率上没有明显差异。相比磷酸氢二钾溶液，以甲醇为提取液所得到的上样液更为澄清，过柱流畅不易堵。此外，将提取后的残渣用甲醇进行二次提取，未检出洛克沙胂。因此，确定本实验的提取液为甲醇，提取液体积为20mL。

2.4 净化条件的优化

通过实验发现，与文献报道类似，MAX小柱更适合于洛克沙胂的净化富集[14,15]。淋洗液和洗脱液的选择和考察在笔者的论文中已有论述，不再赘述[16]。实验选择以MAX小柱为固相萃取柱，淋洗液为5mL水和5mL甲醇，洗脱液为15%甲酸甲醇溶液。并在此基础上考察实际饲料样品的净化条件。

根据化合物的特质和实验表明，在有机相体系中，目标物在碱性条件下能更好地保留在固定相上。在处理实际饲料样品时发现，有部分饲料样品经甲醇提取后样液的酸度较大，直接上柱后目标物无法极好地保留到小柱上。

由笔者前期文章[16]淋洗液和洗脱液的考察实验和结论表明，在有机相体系里，目标物对洗脱液的酸度要求较为苛刻，以常规的5%甲酸甲醇溶液不能将目标物从小柱上洗脱，反观目标物在碱化的有机相体系中较好地保留到小柱上的可能性较大。因此，考虑通过在样品提取液中加入氨水的方式调节酸碱度以保证目标物在小柱上的保留。

选取有代表性的3种饲料，分别称取5份各2g，置于50mL离心管中，加入洛克沙胂标准溶液，使洛克沙胂在饲料中的含量为0.2mg·kg-1，准确加入20.00mL甲醇，振荡提取20min，离心10min，分别取上清液5.00mL于7个试管中，分别加入氨水0mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、1.0mL混匀后上柱按已确定淋洗液和洗脱液操作后吹干复溶上机。计算方法回收率所得结果如图2所示。

由图2可知，极少量氨水的加入对回收率的影响不大，当氨水加入体积为0.5mL时，3种基质的回收率表现均达到80%左右，继续增加氨水的体积对实验结果无影响，同时考虑到柱子的容积为6mL，确定样液中加入氨水的体积为0.5mL。因此，确定饲料经甲醇提取后样液的净化条件：取5mL上清液，加入0.5mL氨水混匀后上柱，分别用5mL水和5mL甲醇淋洗，最后用5mL的15%甲酸甲醇溶液洗脱。

图2 3种基质条件下氨水体积对回收率的影响

2.5 基质效应的考察

取不同基质的饲料样品，按已确认的前处理方法步骤处理至氮吹至干，分别加入2mL浓度为25ng·mL-1和200ng·mL-1的标准溶液，涡旋混匀。制得理论浓度为25ng·mL-1和200ng·mL-1的基质匹配标准溶液，过滤膜后上机测试得到目标物的峰面积，通过与25ng·mL-1或200ng·mL-1标准溶液峰面积的比值考察基质效应，所得结果如表6所示。

表6 不同饲料样品的基质效应考察

实验结果表明，目前确认的前处理方法所获得基质溶液对目标物洛克沙胂的质谱响应有一定的影响，因此选择基质匹配标准溶液进行校正定量。

2.6 饲料中洛克沙胂检测的工作曲线、相关系数(r)、检测限(LOD)

精密取适量洛克沙胂标准工作液，用0.1%甲酸-甲醇水溶液稀释至洛克沙胂浓度为5ng·mL-1、10ng·mL-1、25ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1的标准曲线系列工作溶液。称取不同基质的空白样品各6份，按已确认的前处理方法处理至氮吹至干，分别加入2mL上述标准系列工作溶液，涡旋混匀。制得理论浓度为5ng·mL-1、10ng·mL-1、25ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1的基质匹配标准系列溶液，过滤膜后在优化的色谱和质谱条件下进行测定，以组分的峰面积对其质量浓度绘制标准曲线，计算线性方程及相关系数，具体结果见表7。

表7 洛克沙胂的线性方程、线性范围、相关系数

2.7 方法的检出限和定量限

饲料基质复杂，因此，本实验选择猪用配合饲料、鸡用配合饲料、鸭用配合饲料分别作为考察对象。在上述空白饲料中添加一定浓度的洛克沙胂对照品，按照本标准进行试验。依据信号与噪声比例，即s/n≥3的浓度为检出限，s/n≥10的浓度为定量限的原则，确定了本方法的检出限为0.02mg·kg-1，定量限为0.05mg·kg-1。典型图谱见图3～5。

图3 空白猪用配合饲料色谱图

图4 猪用配合饲料检出限添加浓度色谱图

图5 猪用配合饲料定量限添加浓度色谱图

2.8 回收率和精密度

配合饲料中洛克沙胂测定的回收率和日间与日内精密度见表8。实验结果表明，在3种饲料基质中，低、中、高3个添加水平的回收率在65.9%～75.2%。日内测定的RSDintra(n=6)在3.5%～6.3%，日间测定的RSDinter(n=3)在4.3%～8.6%。

3 结论与讨论

本文建立了配合饲料中洛克沙胂的测定方法，以甲醇为提取液，离心后取上清液经氨水调节pH后过MAX小柱净化，吹干后以含有0.1%甲酸的10%甲醇水溶液复溶后上LC-MS检测，方法精密度高，回收率较好。相对于国标方法，本方法极大地提高了检测的灵敏度，获得了较低的检出限。前处理过程中增加了调节上柱液pH值的过程，对不同基质的饲料有了更好的适用性，基本能够完全满足日常检测的需求。除了洛克沙胂外，还有氨苯砷酸等其它有机砷制剂，下一步将基于目前的样品前处理方法，开发适用于多种有机砷测定的高效液相色谱串联质谱的检测方法，为动物产品质量安全、公共卫生安全和生态安全提供更加便捷的技术支撑。

表8 回收率和日内、日间标准偏差