血清lncRNA TUG1和miR-542-3p表达与急性脑梗死患者病情和预后的关系

王 瑞 姜晓霞 裴雯雯 刘丹丹 张春燕

临汾市人民医院，山西 临汾041000

急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）是一种严重危害全球人类健康的缺血性脑血管疾病［1-2］。近年来ACI 患病率和致残率呈上升趋势，给社会和家庭带来严重的负担［3］，积极寻找能够预测疾病严重程度和预后的特异性标志物具有重要意义。长链非编码RNA 牛磺酸上调基因1（long non-coding RNA taurine up-regulated gene 1，LncRNA TUG1）最早被发现与视网膜发育关系密切［4］。LncRNA TUG1过表达在动脉粥样硬化和缺血性脑卒中等疾病中发挥重要作 用［5-6］。miR-542-3p 是 一 种 内 源 性miRNA，是miR-542 亚型之一［7］。miR-542-3p 可在正常脑组织中表达，在人脑胶质瘤细胞中表达降低，可抑制细胞的侵袭及迁移［8］，推测其可能也参与急性脑梗死的发展进程。生物信息学分析显示miR-542-3p中存在与lncRNA TUG1 互补结合的核酸序列。目前lncRNA TUG1、miR-542-3p 与ACI 严重程度及预后之间的关系研究较少。本研究旨在探讨lncRNA TUG1、miR-542-3p 在ACI 患者血清中的表达与疾病程度和预后的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2020-01—2021-12 在临汾市人民医院就诊并确诊为ACI 的患者174 例（研究组），其中男85 例，女89 例，年龄（66.70±6.62）岁。选取150 例健康者为对照组，其中男80 例，女70 例，年龄（67.24±6.35）岁。纳入标准：（1）诊断符合《中国急性缺血性脑卒中诊疗指南2018》［9］中的标准；（2）所有患者均经头颅CT/MRI 确认为脑梗死；（3）发病后24 h 内入院；（4）首次发病。排除标准：（1）有恶性肿瘤、痛风性关节炎、肾脏病、全身感染或自身免疫性疾病史者；（2）合并其他严重疾病（如急性心肌梗死、呼吸衰竭、肾衰竭、休克、昏迷、败血症）者；（3）发病后7 d 内死亡或未完成90 d 随访者；（4）意识障碍、失语、痴呆患者。本研究所有对象均征得患者及家属知情同意，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及临床指标检测：ACI 患者于入院当日，对照组于体检当日清晨采集空腹静脉血5 mL，4 ℃、3 000 r/min离心20 min，分离血清标本，—80 ℃保存备用。采用生化分析仪器检测甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。采用常规血糖仪检测血糖，电子血压计测量收缩压、舒张压。

1.2.2 实时荧光定量PCR 法检测血清lncRNA TUG1、miR-542-3p水平：采用实时荧光定量PCR法检测血清lncRNA TUG1、miR-542-3p的表达水平。采用miRNeasy血清高级试剂盒（Qiagen）提取总RNA，在制造商的指导下用iScriptTMcDNA Synthesis Kit（Bio-Rad）进行反转录，按照制造商的指导使用THUNDERBIRD®SYBR®qPCR Mix（Toyobo）进 行qPCR。采用2-△△CT法对lncRNA TUG1、miR-542-3p 的相对表达量进行定量分析。

1.2.3 疾病严重程度及预后评估：ACI 患者均在入院后第1 天进行疾病严重程度评估，采用美国国立卫生研究院卒中量表（National Institute of Health stroke scale，NIHSS）评分，总分范围0～42 分，分数越高表明疾病越严重。本研究中轻度患者70 例（NIHSS 评分<5 分），中度患者55 例（5 分≤NIHSS 评分<16分），重度患者49例（NIHSS评分≥16分）。通过电话或门诊对患者进行90 d 的短期随访，采用改良Rankin 量表（modified Rankin scale，mRS）评分评估患者预后，总分范围0～5分，总分越高表明患者预后越差［9］。本研究中预后不良患者70例（mRS评分>2分），预后良好患者104例（mRS评分≤2分）。

1.3 统计学分析应用SPSS 22.0 进行统计学分析，计数资料采用例数（%）表示，进行χ2检验。计量资料经检验符合正态分布采用均数±标准差（±s）表示，进行t 检验；多组数据间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q 检验。Pearson 法分析lncRNA TUG1、miR-542-3p 表达的相关性。受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线预测血清lncRNA TUG1、miR-542-3p 水平对ACI 患者预后不良的预测价值。Logistic 回归分析影响ACI 患者预后的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组一般资料对比2组性别、年龄、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高血压史、血糖、TG 比较差异均无统计学意义（P>0.05）。研究组患者收缩压、舒张压、TC、LDL-C水平均显著高于对照组，HDL-C水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 2组一般资料比较Table 1 Comparison of general data of two groups

2.2 2 组血清lncRNA TUG1、miR-542-3p 的相对表达量比较ACI 患者血清lncRNA TUG1 表达水平高于对照组，miR-542-3p表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 2组血清lncRNA TUG1、miR-542-3p的相对表达量比较 （±s）Table 2 Comparison of the relative expression level of serum lncRNA TUG1 and miR-542-3p between the two groups （±s）

表2 2组血清lncRNA TUG1、miR-542-3p的相对表达量比较 （±s）Table 2 Comparison of the relative expression level of serum lncRNA TUG1 and miR-542-3p between the two groups （±s）

组别研究组对照组t值P值n 174 150 lncRNA TUG1 2.72±0.89 1.01±0.33 22.246＜0.001 miR-542-3p 0.51±0.14 1.21±0.38 22.590＜0.001

2.3 ACI 患者血清lncRNA TUG1 与miR-542-3p的相关性采用TargetScan 数据库（http://www.targetscan.org/）进行生物信息学分析，预测结合位点，结果显示lncRNA TUG1 与miR-542-3p 具有靶向关系。Pearson 分析显示ACI 患者血清miR-542-3p 与lncRNA TUG1 呈显著负相关（r= —0.492，P<0.05）。见图1。

图1 ACI患者血清lncRNA TUG1与miR-542-3p的相关性分析Figure 1 Correlation analysis of lncRNA TUG1 and miR-542-3p expression in serum of ACI patients

2.4 各组ACI患者血清lncRNA TUG1、miR-542-3p的相对表达量比较与轻度组患者比较，重度组和中度组患者血清lncRNA TUG1表达、NIHSS评分升高，且重度组表达水平高于中度组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；重度组和中度组患者血清miR-542-3p 表达降低，且重度组表达水平低于中度组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组血清lncRNA TUG1、miR-542-3p的相对表达量、NIHSS评分比较 （±s）Table 3 Comparison of the relative expression levels of serum lncRNA TUG1 and miR-542-3p and NIHSS score in each group （±s）

表3 各组血清lncRNA TUG1、miR-542-3p的相对表达量、NIHSS评分比较 （±s）Table 3 Comparison of the relative expression levels of serum lncRNA TUG1 and miR-542-3p and NIHSS score in each group （±s）

注：与轻度组比较，aP＜0.05；与中度组比较，bP＜0.05

组别重度组中度组轻度组F值P值n 49 55 70 lncRNA TUG1 3.85±1.03ab 2.69±0.89a 1.95±0.81 70.877＜0.001 miR-542-3p 0.32±0.09ab 0.45±0.14a 0.68±0.15 113.641＜0.001 NIHSS评分/分19.21±2.33ab 9.03±1.14a 3.12±0.08 1931.276＜0.001

2.5 不同预后患者一般资料及lncRNA TUG1、miR-542-3p的相对表达量比较预后不良组患者的lncRNA TUG1、收缩压、NIHSS 评分明显高于预后良好患者，miR-542-3p 明显低于预后良好患者（P＜0.05）。见表4。

表4 不同预后患者一般资料及lncRNA TUG1、miR-542-3p的相对表达量比较 （±s）Table 4 Comparison of general data and relative expression levels of lncRNA TUG1 and miR-542-3p in patients with different prognosis （±s）

表4 不同预后患者一般资料及lncRNA TUG1、miR-542-3p的相对表达量比较 （±s）Table 4 Comparison of general data and relative expression levels of lncRNA TUG1 and miR-542-3p in patients with different prognosis （±s）

资料性别（男/女）年龄/岁吸烟史［n（%）］饮酒史［n（%）］糖尿病史［n（%）］高血压史［n（%）］收缩压/mmHg舒张压/mmHg血糖/（mmol/L）TC/（mmol/L）TG/（mmol/L）HDL-C/（mmol/L）LDL-C/（mmol/L）NIHSS评分/分lncRNA TUG1 miR-542-3p预后不良组（n=70）35/45 67.18±6.73 30（42.86）17（24.29）15（21.43）29（41.43）137.67±28.13 89.93±10.03 8.45±1.83 3.86±0.71 1.41±0.46 1.21±0.27 2.12±0.77 13.01±1.06 3.49±0.94 0.36±0.11预后良好组（n=104）50/54 66.38±6.55 42（40.38）32（30.77）17（16.35）36（34.62）129.02±27.23 87.47±9.19 8.24±1.78 3.80±0.64 1.36±0.43 1.26±0.22 2.07±0.72 7.17±1.04 2.21±0.86 0.61±0.16 t/χ2值0.341 0.441 0.105 0.869 0.720 0.830 2.028 1.669 0.755 0.580 1.964 1.340 0.437 36.042 9.272 11.382 P值0.559 0.660 0.745 0.351 0.396 0.362 0.044 0.097 0.452 0.256 0.051 0.182 0.663＜0.001＜0.001＜0.001

2.6 血清lncRNA TUG1、miR-542-3p对ACI患者预后不良的预测价值ROC曲线显示，血清lncRNA TUG1、miR-542-3p 预测ACI 患者预后不良的AUC 分别为0.857（95%CI：0.796～0.905）、0.911（95%CI：0.859～0.949），对应的敏感度分别为85.71%、81.43%，特异度分 别 为75.00%、87.50% ；血 清lncRNA TUG1、miR-542-3p联合预测的AUC为0.954（95%CI：0.912～0.980），敏感度为82.86%，特异度为96.15%。见图2、表5。

表5 血清lncRNA TUG1、miR-542-3p对ACI患者预后不良的预测价值Table 5 Predictive value of serum lncRNA TUG1 and miR-542-3p for poor prognosis in patients with ACI

图2 血清lncRNA TUG1、miR-542-3p预测ACI患者预后不良的ROC曲线Figure 2 ROC curve of serum lncRNA TUG1 and miR-542-3p levels in predicting poor prognosis of ACI patients

2.7 预后不良的影响因素分析以ACI患者预后不良为因变量，以lncRNA TUG1、miR-542-3p、NIHSS评分、收缩压为自变量，进行Logistic回归分析，结果显示lncRNA TUG1、miR-542-3p、NIHSS 评分均与ACI患者预后不良相关（P＜0.05）。见表6。

表6 多因素Logistic回归分析Table 6 Multivariate Logistic regression analysis

3 讨论

由于神经元的不可再生性，ACI具有极高的致残率和复发率［11-12］。随着人们生活方式及饮食结构的改变，高血压、糖尿病等发病率逐渐升高，造成ACI的发病也呈上升趋势，且趋于年轻化［13］。寻找影响ACI预后的因素以及预测其预后不良的生物标志物，对降低ACI并发症发生率具有重要意义。

lncRNA 是一种长度超过200 bp 的非编码RNA。目前人类已发现15 000 多种lncRNA，但对其结构知之甚少。lncRNA与肿瘤、心血管疾病、内分泌疾病等多种疾病的发生、发展有关［14］。近年来，在缺血性脑卒中患者和动物模型中发现了数百个异常表达的lncRNA，表明lncRNA 与缺血性脑卒中密切相关，有可能成为缺血性脑卒中的生物标志物和治疗靶点［15］。LncRNA TUG1位于人染色体22q12.2［16］。研究显示lncRNA TUG1在急性脑梗死患者血清中表达升高，在疾病诊断中具有重要临床价值［17］。另有研究显示TUG1在缺血性脑卒中患者中表达升高，可能造成神经元损伤从而影响疾病［18］。本研究中ACI患者血清lncRNA TUG1表达水平高于对照组，且随着疾病程度加重而逐渐升高，预后不良患者血清lncRNA TUG1表达水平高于预后良好患者，提示lncRNA TUG1可能参与ACI的发生、发展过程，且与疾病程度和患者预后密切相关，有望成为评估ACI疾病严重程度及预后不良的潜在血清学指标。本研究中ROC曲线显示血清lncRNA TUG1水平预测ACI患者预后不良的AUC分别为0.857，敏感度为85.71%，特异度为75.00%，表明检测ACI 患者血清lncRNA TUG1 水平可用于ACI患者预后判断。

miRNA 是真核生物中高度保守的非编码RNA，可参与调控早期胚胎分化、发育、细胞增殖、分化、凋亡、炎症等过程。miRNA还在脑缺血的各个方面发挥多重作用，调节细胞凋亡、分化、血管炎症反应、缺血再灌注损伤等［18］。miR-542-3p位于X染色体q26.3区域［20］，miR-542-3p在脑胶质瘤、癫痫、脑缺血再灌注损伤等多种疾病中发挥作用［21-22］。本研究中ACI患者血清miR-542-3p相对表达量低于对照组，且随着疾病程度加重而降低，表明miR-542-3p与ACI患者疾病严重程度及预后密切相关。本研究Pearson相关性分析显示ACI患者血清miR-542-3p和lncRNA TUG1表达呈负相关，提示二者之间存在某种负反馈调节机制，lncRNA TUG1 可能通过靶向miR-542-3p，抑制其表达，从而参与疾病的发展进程［23-30］。预后不良患者的miR-542-3p明显低于预后良好患者，miR-542-3p水平越低可能预示预后不良的发生率更高。本研究中ROC曲线显示血清miR-542-3p水平预测ACI患者预后不良的AUC 为0.911，敏感度为81.43%，特异度为87.50%，与lncRNA TUG1 水平联合预测的AUC 为0.954，敏感度为82.86%，特异度为96.15%，表明联合检测二者在ACI患者血清中的表达可用于预测预后不良，且预测效能高于单一指标检测，可为降低ACI患者的预后不良发生率提供依据。ACI患者收缩压、舒张压、TC、LDL-C水平均显著高于对照组，HDL-C水平低于对照组，且预后不良组患者的收缩压、NIHSS评分均明显高于预后良好患者，Logistic 回归分析表明lncRNA TUG1、miR-542-3p、NIHSS 评分均是影响ACI 患者预后的因素，进一步表明lncRNA TUG1 和NIHSS评分升高、miR-542-3p表达降低均与ACI患者预后不良密切相关［31］。

lncRNA TUG1、miR-542-3p是ACI患者预后的独立影响因素，可为ACI 疾病进展和预后评估提供参考依据，具有重要的临床意义。本研究尚有不足之处，未探究二者发挥作用的确切机制，且纳入样本较少，在今后的研究中将进行更深入的探讨。