柊叶中醇溶性物质的提取及其抑菌活性研究

刘 钊，柯 玲

（肇庆学院 食品与制药工程学院，广东 肇庆 526061）

柊叶属于竹芋科，是多年生草本植物，广布于亚洲南部地区，形似芭蕉叶，气味清香，具有清热解毒、解酒、防腐等功能[1-2].在广东肇庆地区人们常用柊叶包裹蒸棕，可以起到防腐保鲜的作用，其中肇庆的特产裹蒸粽已久负盛名[3].柊叶的性质与传统的粽叶近似，具有相似的活性成分，如黄酮类、生物碱、多酚化合物、生物活性多糖等，具有抑菌、抗氧化、驱虫等功能[4-6].目前，关于粽叶的活性成分提取、精油提取、粽叶的成分检测常有报道，而柊叶作为一种裹蒸粽的包裹材料对其研究并不多.柊叶的研究多数停留在种植传粉、环境生态布局等方面[7-8].

现代很多防腐原料大多数是化学合成的化合物，而柊叶是天然的防腐原料，对人体以及环境均不造成危害.研究提取柊叶的活性成分及其抑菌、防腐性能有助于其在食品包装、食品药品加工等领域应用和发展.本文以柊叶为材料，用乙醇提取的方法研究提取出醇溶性活性物质，并探讨此醇溶性物质的抑菌活性，为其在抑菌防腐等领域进一步研究提供参考.

1 材料与仪器

1.1 材料

新鲜柊叶，市售；马铃薯，市售；大肠杆菌（GDMCC1.223）、枯草芽孢杆菌（GDMCC1.151 7）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）和黑曲霉菌（CMCC（F）98003）均购自广东环凯微生物科技有限公司；牛肉浸膏（生化试剂，广东环凯微生物科技有限公司）；细菌学蛋白胨（生化试剂，广东环凯微生物科技有限公司）；琼脂粉（生化试剂，青岛德慧海洋生物科技有限公司）；无水乙醇（分析纯，广州化学试剂厂）；丙酮（分析纯，广州化学试剂厂）.

1.2 仪器

循环水式多用真空泵（SHZ-D（III），邦西仪器科技（上海）有限公司）；低温冷却循环水槽（CCA-20，巩义市予华仪器有限责任公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DGX-9143 B-1，上海福玛实验设备有限公司）；手提式压力蒸汽灭菌器（XFS-280，浙江新丰医疗器械有限公司）；EVELA恒温培养箱（SLI-400，上海爱朗仪器有限公司）；EVELA旋转蒸发仪（N-1300，上海爱朗仪器有限公司）.

2 实验方法

2.1 柊叶醇溶性物质提取

取新鲜的柊叶洗净，去枯黄部分以及表面的水滴.将柊叶装盘置于干燥箱中，50℃干燥烘干.将干燥的柊叶用粉碎机粉碎，置于密封袋中.在电子天平上准确称量柊叶粉，将粉末倒入250 mL碘量瓶中，再准确量取无水乙醇，于室温下浸泡.将浸提液过滤，取滤液于旋蒸瓶中，并于50℃下进行旋蒸，旋蒸干之后称重量，用丙酮溶液定容.

2.1.1 乙醇浓度对醇溶性物质提取率的影响

提取时间3 h，料液比1:10 g/mL,探讨乙醇浓度对醇提取物提取率的影响.设定实验的其它单因素参数不变，选取乙醇浓度5 个水平分别为20%、40%、60%、80%、99.5%，对提取产物进行称量并计算提取率.

2.1.2 提取时间对醇溶性物质提取率的影响

乙醇浓度80%，料液比1:10 g/mL,探讨提取时间对醇提取物提取率的影响.设定实验的其它单因素参数不变，选取反应时间5 个水平分别为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，对提取的产物进行称量并计算提取率.

2.1.3 料液比对醇溶性物质提取率的影响

乙醇浓度80%，提取时间3 h，探讨料液比对醇提取物提取率影响.设定实验的其它单因素参数不变，选取料液比5 个水平分别为1:1、1:5、1:10、1:15、1:20，对提取产物进行称量并计算提取率.

2.1.4 正交试验

根据乙醇浓度、反应时间、料液比等3 个因素的单因素实验情况设计L9（34）的正交试验.

2.1.5 提取率的计算

2.2 柊叶中醇溶性物质抑菌活性的测定

2.2.1 培养基制备[9-10]

牛肉膏蛋白胨培养基：称取牛肉浸膏1.5 g；蛋白胨5.0 g；氯化钠2.5 g；琼脂10.0 g；去离子水500 mL 加热，将以上试剂加入水中溶解，补充水分至500 mL 得固体培养基.用1 mol/L 的氢氧化钠溶液将pH 调节至7.0～7.5，把所得培养基装瓶，封好口，放入灭菌锅湿热灭菌20 min（温度为121℃）.该配方不掺入琼脂即是液体培养基.

马铃薯培养基制备：重20 g土豆去皮，切成约1 cm3的马铃薯小块，加100 mL去离子水煮约30 min，剪一块4 层纱布进行过滤，添加2 g蔗糖和1 g琼脂于滤液中，搅拌使其溶解，加水定容至100 mL，所得培养基装入锥形瓶密封，置于121℃灭菌器中20 min.该配方不掺入琼脂即是液体培养基.

2.2.2 菌悬液制备[11]

对应4 种供试菌，分别制备斜面培养基，用接种环在无菌操作下，刮取适量菌种于斜面培养基上，置于培养箱中培养（细菌：37℃培养24 h，霉菌：28℃培养48 h），使其活化.然后，刮取1环已活化的菌种于4.0 mL已配置好的液体培养基中，置于培养箱中培养8 h，所得即为悬浮液.

2.2.3 低抑菌浓度MIC的测定[12-13]

将柊叶醇提取物用丙酮定容，以100 mg/mL 作为初始浓度，再用丙酮溶液进行倍比稀释.取实验室用一般滤纸，用打孔器压打出直径为6 mm的圆片，放入试管中进行密封灭菌（121℃，20 min）.每一个培养皿倒入适量（约4 mm厚）的已配好且灭菌（121℃，20 min）的培养基，静置至凝固后，用移液管移取0.1 mL已制成一定浓度的菌悬液至凝固的培养皿中，再用无菌涂布棒均匀涂布.将用于试验的配制成100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL5 个所需的浓度，已灭菌的滤纸分别放入到5 个浓度的溶液当中浸透.一段时间后，用无菌镊子从试管中夹起滤纸，夹出时在试管边沿停留片刻，滤去多余的浸泡液，再将滤纸放在已冷凝好的培养基表面.对每一个浓度进行3次平行测试，以无菌水浸湿的滤纸作为空白，以丙酮浸湿的滤纸作为对照.在适当温度下（细菌37℃，霉菌28℃）培养一定时间后（细菌24 h，霉菌48 h）观测，用尺子测量抑制区大小，计算抑制率.以没有抑制区的最低提取物浓度为柊叶提取物的最小抑制浓度（MIC）.

2.2.4 菌率的计算[14-16]

3 结果分析

3.1 单因素实验结果分析

3.1.1 乙醇浓度对醇溶性物质提取率的影响

由图1可知，随着乙醇浓度提高，浸提物颜色愈来愈深，提取率愈来愈高，乙醇浓度为99.5%（无水乙醇）时，醇提取物的提取率最高为7.00%.由于乙醇能促进黄酮类、生物碱、多酚化合物等溶出，故乙醇浓度对柊叶中活性成分的提取有较大影响.

图1 乙醇浓度对醇溶性物质提取率的影响

3.1.2 提取时间对醇溶性物质提取率的影响

由图2可知，随着提取时间增加，提取率提高.提取时间为4 h时，醇提取物的提取率最高，其提取率为5.50%，4 h后提取率变化不大.提取时间不足，柊叶与乙醇溶液的接触不充分，导致提取结果不理想，提取率较低；但提取时间过长，提取效率不高.

图2 提取时间对醇溶性物质提取率的影响

3.1.3 料液比对醇溶性物质提取率的影响

从图3可见，当料液比为1:5时，提取率为6.50%.随着料液比增加，醇溶物提取率增加，从实验可知，当料液比在1:5时，提取率提高已不明显，提取已接近饱和状态.料液比越大，使用溶剂量不断增多，容易造成资源浪费，从成本和环保方面考虑，料液比在1:5时比较适合.

图3 料液比对醇溶性物质提取率的影响

3.2 正交试验结果分析

采取L9（34）正交试验设计（表1），研究各因素水平对柊叶醇提取物提取率的影响，通过提取率的大小确定最佳方案的因素参数（表2）.

表1 因素水平表

表2 L9 （34） 正交实验结果

由表2可知，影响柊叶醇溶性物质提取率的因素主次为：乙醇浓度＞料液比＞提取时间.因此，最优提取方案为A3B2C1，即乙醇浓度99.5%、提取时间4 h、料液比1:5 g/mL.在正交试验表中出现了方案A3B2C1且其提取率也是最高，可达8.0%，与正交试验的理论最优方案相一致，故本实验最佳方案为A3B2C1.

3.3 抑菌效果分析

3.3.1 醇溶性物质对大肠杆菌的抑菌作用

醇溶性物质对大肠杆菌的抑菌作用见表3.

表3 醇溶性物质各系列浓度对大肠杆菌的抗菌作用分析

由表3可见，抑制区的直径随着柊叶提取物浓度的降低而一直在减小.说明柊叶醇溶性物质浓度下降对大肠杆菌的抗菌作用越来越弱，且在醇溶性物质浓度为6.25 mg/mL时，抑制区的直径为滤纸的直径，抑菌率为0，表明在此浓度下不抑制大肠杆菌.

3.3.2 醇溶性物质对枯草芽孢杆菌的抑菌作用效果

由表4可见，抑制区的直径随着柊叶醇溶性物质浓度的降低而减小,说明柊叶醇溶性物质浓度下降对枯草芽孢杆菌的抑菌作用越来越弱，且在浓度为12.5 mg/mL时，抑制区的直径为滤纸的直径，抑制率为0，表明在此浓度下对枯草芽孢杆菌没有抑制作用.

表4 醇溶性物质各系列浓度对枯草芽孢杆菌的抗菌作用分析

3.3.3 醇溶性物质对金黄色葡萄球菌的抑菌作用效果

由表5可见，抑制区的直径随着柊叶醇溶性物质浓度的降低一直在减小,说明柊叶醇溶性物质浓度下降对金黄色葡萄球菌的抑菌作用越来越弱，且在浓度为6.25 mg/mL时，抑制区的直径为滤纸的直径，抑制率为0，表明在此浓度下不抑制金黄色葡萄球菌.

表5 醇溶性物质各系列浓度对金黄色葡萄球菌的抗菌作用分析

3.3.4 醇提物对黑曲霉的抑菌作用效果

由表6可见，抑制区的直径随着柊叶醇溶性物质浓度的降低而减小,说明柊叶醇溶性物质浓度对黑曲霉的抑菌作用越来越弱，且在浓度为6.25 mg/mL时，抑制区的直径为滤纸的直径，抑菌率为0，表明在此浓度下提取物对黑曲霉没有抑制作用.

表6 醇溶性物质各系列浓度对黑曲霉的抗菌作用分析

3.3.5 柊叶醇提取物对供试菌最低抑菌浓度（MIC）的测定结果

从表7可见，柊叶醇溶性物质对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉4种菌种呈现出不同程度的抑制作用.柊叶醇溶性物质对大肠杆菌的MIC为6.25 mg/mL、对枯草芽孢杆菌的MIC为12.5 mg/mL、对金黄色葡萄球菌的MIC为6.25 mg/mL、对黑曲霉的MIC为6.25 mg/mL.可见，柊叶醇溶性物质对不同细菌的抑菌效果存在一定的差异性.

表7 柊叶醇提取物对供试菌最低抑菌浓度（MIC）的测定结果分析

4 结论

柊叶在广东地区常用于包裹蒸粽，也有少部分药用.关于其活性成分的提取及应用比较少见于报道.本研究通过醇提的方法初步探讨了柊叶醇溶性物质的提取情况及其抑菌活性.通过单因素与正交试验研究，主要影响柊叶醇溶性物质的提取因素有：乙醇浓度、提取时间、料液比等，且这几个因素影响的主次为：乙醇浓度＞料液比＞提取时间.柊叶醇溶性物质提取的最佳方案为：乙醇浓度99.5%、提取时间4 h、料液比1:5 g/mL，提取率可达8.0%.除此之外，还考察了柊叶醇溶性物质的抑菌活性，结果显示：柊叶醇溶性物质对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉呈现了不同程度的抑菌作用，并且抑菌的效果在浓度小于等于100 mg/mL时，随着醇溶性物质浓度的提高而增加.实验还初步探讨了柊叶醇溶性物质对被测菌种的最低抑菌浓度（MIC），4种菌种的MIC为：大肠杆菌6.25 mg/mL、枯草芽孢杆菌12.5 mg/mL、金黄色葡萄球菌6.25 mg/mL、黑曲霉6.25 mg/mL.通过实验研究，说明了柊叶中含有一定的抑菌活性成分，本实验研究结果可为在食品保藏、功能性食品领域、药品领域等方面的开发研究提供参考.