基于网络药理学及分子对接探讨健脾止动汤通过脑肠轴治疗儿童多发性抽动症的分子机制

张莎莎，王素梅，唐艳鹏，王晓聪，郝宏文

(1. 北京中医药大学，北京 100029；2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078)

多发性抽动症是一种复杂的神经精神疾病，以慢性、波动性、多发性的运动肌肉抽动和(或)伴有不自主的发声性抽动为主要临床表现，常共患强迫症、注意缺陷障碍等其他神经精神障碍而影响认知。本病患病率在0.4%～3.8%，男性多于女性，男女比例约为3～4∶1[1]。近年来，多发性抽动症的患病率有明显上升的趋势。本病多在儿童时期发病，病情反复，常持续1年以上，部分患儿病情可迁延至成年或伴随终生。研究认为多发性抽动症的发病机制可能与遗传神经免疫、神经病理、解剖、环境等因素有关。西医常以抗精神病类药物治疗，但不良反应较为明显，给患儿及家长造成身心负担，造成患儿依从性差。因此，寻找高效、低毒的治疗药物是目前儿童多发性抽动症的研究热点。Meta分析结果显示, 与西药相比, 中药治疗可以获得更好的YGTSS评分有效率和更低的中医症状积分和复发率,且不良反应率明显低于西药治疗[2]。健脾止动汤是全国名老中医王素梅教授在总结多年治疗经验依据泻青丸和六君子汤加减而成，该方由太子参、白术、茯苓、陈皮、半夏、川芎、当归、防风、钩藤、龙胆组成，具有健脾平肝、化痰熄风的功效。本课题组前期临床研究显示健脾止动汤可以有效治疗儿童多发性抽动症，显著降低患儿的YGTSS评分,降低患儿血清多巴胺(Dopamine,DA)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)及谷氨酸(glutamic acid,GLU)水平,升高γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)含量[3]；并在动物实验中证实健脾止动汤可以通过调控多种神经递质及纹状体区脑源性神经营养因子等神经营养因子的表达抑制抽动症状[4]。脑肠轴是中枢神经系统与胃肠道之间的双向信息交互系统，其中肠道菌群起着关键作用。研究证实，肠道菌群可以通过介导炎症的产生、调控下丘脑-垂体-肾上腺轴和调节神经递质等途径对神经系统产生影响，粪便移植对多发性抽动症具有有益作用[5]，故推测该方可能通过脑肠轴调节神经递质及免疫抑制抽动症状。

网络药理学是一种以药物成分、蛋白靶点以及疾病相互作用网络为基础，整合了生物信息学、药理学、计算机技术，其系统性、整体性、联系性的特点与中医辨证论治、整体观、方剂配伍的理论相一致。因此，本研究将基于此方法分析健脾止动汤通过脑肠轴治疗儿童多发性抽动症的作用靶点及机制，为进一步研究健脾止动汤治疗儿童多发性抽动症的作用机制及临床应用提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1健脾止动汤药物成分的获取 通过中药系统药理学分析数据库TCMSP(https://www.tcmspw.com)检索健脾止动汤中药物太子参、茯苓、白术、陈皮、半夏、防风、钩藤、川芎、当归、龙胆的化学成分及作用靶点，并根据药物口服生物利用度(OB≥30%)、类药性指数(DL≥0.18)为条件进行筛选。

1.2药物及疾病的靶点预测 通过Swisstargetprediction 数据库(http://www.swisstargetpredictio-n.ch/)获得各药物成分相应的靶点蛋白，并应用Uniprot 蛋白质数据库(htt-ps://www.uniprot.org/)将蛋白质靶点对照为标准基因名称，并去除非人源基因。通过GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.om-im.org/)、TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)等数据库，以“T-ourette syndrome”为关键词进行搜索，删去重复项后得到与儿童多发性抽动症相关的疾病基因。

1.3健脾止动汤成分-多发性抽动障碍共同靶点获取及PPI网络的构建 为明确药物靶点和疾病靶点在蛋白水平上的作用机制，将药物基因与疾病基因提交至韦恩图绘制网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ind-ex.html)，绘制韦恩图并获取二者的交集基因，并将交集基因上传到STRING基因数据库(https://string-db.org/)构建蛋白互作网络模型。将物种设定为“Homo sapiens”，最小相互作用阈设置为“medium confidence”，并隐藏游离蛋白，得到PPI网络。将 PPI 网络下载保存为Tsv格式，并导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化处理。

1.4药物-成分-疾病-靶点网络图构建 应用Cytoscape 3.7.2软件构建药物-成分-疾病靶点互作网络，节点(node)代表活性成分、药物、疾病、靶点，边(edge)代表不同节点之间的相互关系。并通过Network Analyzer功能进行网络拓扑分析，推测健脾止动汤治疗疾病可能的核心活性成分。

1.5GO及其KEGG分析 将疾病与药物的交集靶点录入Metascape网站(https://metascape.org/gp/index.html)进行富集分析，设置 P-value<0.01，得到主要的GO和KEGG通路后，筛选前20条重要通路。

1.6药物成分-核心靶点分子对接验证 从TCMSP数据库(https://www.tcmspw.com)中下载主要活性成分的mol2结构。通过PDB 数据库(https://www.rcsb.org/)下载核心靶点蛋白的3D结构，保存为PDB格式，利用PyMOL软件去除水分子及小分子配体，AutoDockTools软件加氢，对受体和配体进行分子对接，通过对接分数值与氢键数量来评价靶点与活性成分的结合能力与稳定性。使用PyMOL软件对对接结果进行可视化处理。

2 结 果

2.1药物成分的获取 以OB≥30%且DL≥0.18为筛选条件，通过TCMSP数据库筛选后获得健脾止动汤有效成分共96个，其中太子参6个，茯苓6个，白术4个，陈皮5个，半夏12个，防风15个，川芎6个，当归2个，钩藤32个，龙胆8个。

2.2药物及疾病靶点预测 经Uniprot数据库共预测靶1 661个，其中太子参116 个，茯苓32 个，白术23 个，陈皮95个，半夏172个，防风187个，钩藤794个，川芎42个，当归69个，龙胆131个，合并删除重复值后共获得靶点1 361个，得到的靶点信息进行Uniprot ID的标准化。以“Tourette syndrome”为关键词分别在GeneCards，OMIM，TTD数据库补充靶点疾病基因，删去重复值后最终得到靶点1 796个。

2.3药物疾病共同靶点获取及PPI网络构建 将获取的健脾止动汤活性成分靶点与多发性抽动症疾病靶点利用在线网站构建韦恩图得到共同靶点67个(见图1)，推测其可能是健脾止动汤治疗儿童多发性抽动症的潜在靶点。进一步应用STRING11.0平台构建共同靶点PPI网络，将得到的Tsv格式文件导入Cytoscape 3.7.2软件，进行可视化处理(见图 2)。由于 PPI 网络中蛋白的作用是相互的，故归为无向图。该图共有64个节点，494条边，节点大小与颜色反映度值大小。数据分析后发现度值最高的三个靶点基因：c-Fos原癌基因蛋白(Proto-oncogene c-Fos，FOS)、炎症因子白细胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)、钠依赖性5-羟色胺转运体(Sodium-dependent serotonin transporter，SLC6A4)，度值分别为39，32，28，说明它们可能是健脾止动汤治疗儿童多发性抽动症的关键。

图1 健脾止动汤成分-儿童多发性抽动症异常靶点韦恩图

图2 健脾止动汤-儿童多发性抽动症PPI网络

2.4药物-成分-疾病-靶点网络图构建 查找药物疾病共同靶点的活性成分，应用Cytoscape 3.7.2软件构建药物-活性成分-疾病-靶点互作网络(见图3)，并进行拓扑分析。蓝色六边形节点代表药物成分，绿色圆形节点代表药物，黄色菱形节点代表药物靶点，红色三角形代表疾病，紫色正方形代表方剂，图形大小与节点度值相关。数据显示槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇为度值前三的活性成分，度值分别为30，16，15，推测其可能是健脾止动汤对儿童多发性抽动症起治疗作用的主要化学活性成分。同时多成分与多靶点相关，表明中医药治疗疾病具有多种成分-靶点共同作用的特点。

2.5GO分析与KEGG分析 应用Metascape网站对健脾止动汤治疗儿童多发性抽动症进行GO分析与KEGG通路分析，以P值筛选前 20 条重要通路，(见图4～7)。KEGG通路富集分析表明该靶点基因能与神经活性配体受体相互作用、多巴胺突触、5-羟色胺突触、胆碱能信号通路、PI3K-Akt信号通路、催乳素信号通路等有关。Go富集分析表明：在生物过程方面(GO Biological Processes)富集显著的通路有：行为、化学突触传递、有毒物质的反应、运动行为、认知、发育成长等；在细胞组分方面(GO Cellular Componen)富集显著的通路有：突触后膜的组成部分、树突、轴突、DA能突触、神经元细胞体膜等；在分子功能(GO Molecular Functions)富集显著的通路有G蛋白耦联胺受体活性、G蛋白耦联神经递质受体活性、神经递质结合、单胺跨膜转运蛋白活性等。说明健脾止动汤治疗儿童多发性抽动症是通过复杂的分子通路以及各种机制完成的。

图3 健脾止动汤-儿童多发性抽动症药物-成分-疾病-靶点网络图

图4 健脾止动汤治疗儿童多发性抽动症KEGG通路富集分析

图5 健脾止动汤治疗儿童多发性抽动症GO Biological Processes分析

图6 健脾止动汤治疗儿童多发性抽动症GO Cellular Components分析

图7 健脾止动汤治疗儿童多发性抽动症GO Molecular Functions分析

2.6分子对接验证 本研究选取健脾止动汤有效活性成分中degree前3的活性成分(槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇)与degree前3的关键靶点(FOS、IL-6、SLC6A4)进行分子对接验证，并对对接分数大于-7.0 kcal/mol的对接结果利用Pymol软件绘图。成分与靶点的结合能和形成氢键数量是评价结合能力的重要指标。对接分数<-4.25 kcal/mol时表示两者间有一定的结合活性，<-5.0 kcal/mol表示有较好的结合活性，<-7.0 kcal/mol表示有强烈的结合活性[6]，氢键量越多则结合越稳定。对接结果(见表1及图8)显示，除槲皮素和FOS蛋白对接结合能>-5.0 kcal/mol，其他对接分数均<-5.0 kcal/mol，表明关键药物活性成分与核心靶点具有较强的结合活性。除β-谷甾醇未能与FOS形成氢键，稳定性欠佳，其余均能形成氢键增强稳定性。

表1 健脾止动汤核心活性成分与主要靶点蛋白的结合情况

图8 健脾止动汤-儿童多发性抽动症关键药效物质-核心靶点分子对接模式图

3 讨 论

历代医家多认为儿童多发性抽动症属于中医学慢惊风、瘛瘲、抽搐、筋惕肉瞤等范畴，本课题组王素梅教授根据小儿“肝常有余，脾常不足”的病理特点，认为儿童多发性抽动症的发生主要与肝脾两脏关系最为密切，此与脑肠轴具有相同的科学内涵。中医理论虽未明确提出脑肠轴这一概念，但已在众多理论与临床实践中进行描述。如《难经·四十七难》曰“人头者，诸阳之会也”，手阳明经别入脑、支脉通于脑、经筋络属脑，二者在经络上相互联系；《灵枢·平人绝谷》曰“神者，水谷之精气也”，胃肠功能正常，水谷精微才可上充脑窍，在功能上肯定了脑肠间的联系。对于本病治疗，《幼科发挥·慢惊有三因》言:“吐泻何以生风而不可治者？吐泻损脾,脾者,土也。风者,肝木所生也。脾土不足,则肝木乘之,木胜土也。”故应从脾胃入手。健脾止动汤以四君子太子参、白术、茯苓等健脾运脾以杜生痰之源，防风、钩藤等疏风柔肝以袪内外之风，龙胆草以泻肝胆火热，并以陈皮、半夏等理气化痰以治其标，川芎当归行气活血以调久病必瘀。研究发现中医健运脾胃的方药具有维持调节肠道菌群的作用，已证实四君子汤可明显增加小鼠肠道双歧杆菌和乳酸杆菌菌量[7]。

肠道菌群是肠道与中枢神经系统相互作用的核心。正常情况下，肠道的益生菌和致病菌处于一个动态平衡的状态，如果肠道菌群结构紊乱则会导致疾病的发生。肠道菌群可以调节神经递质及免疫系统，目前已证实乳酸杆菌和双歧杆菌能产生GABA，大肠杆菌、芽孢杆菌和酵母菌能产生去甲肾上腺素，假丝酵母菌、链球菌、大肠杆菌和肠球菌能产生5-羟色胺(5-HT)[8]，乳酸杆菌可调控多巴胺能通路改善抽动样行为[9]，双歧杆菌可显著降低血浆C反应蛋白、肿瘤坏死因子α和IL-6水平发挥免疫调节作用[10]。

本研究通过网络药理学筛选出健脾止动汤的主要成分为槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇等。实验证明槲皮素可上调脑源性神经营养因子的表达，通过激活TrkB/ERK/MAPK、PI3K-Akt等通路从而促进神经元细胞存活、调节突触功能,同时可以降低DA含量减少抽动症状[11]；槲皮素可以通过抑制中性粒细胞表达IL-6 mRNA、减少IL-6的合成和分泌, 从而在炎症早期抑制炎症反应而减轻免疫损害[12]。槲皮素对乳酸杆菌体外增殖有明显扶植作用[13]，体内实验证实其可明显抑制蛋鸡肠道有害菌群大肠杆菌等的生长，提高益生菌双歧杆菌的数量[14]。豆甾醇能明显减少氯胺酮引起的小鼠的自发活动、刻板行为，降低DA、肿瘤坏死因子水平，抑制乙酰胆碱酯酶活性，从而改善认知功能[15]。β-谷甾醇可抑制小动物自主活动，其可能是通过抑制巨噬细胞IL-6和肿瘤坏死因子α活性[16]，或产生类似于氢化可的松通过下丘脑-垂体-肾上腺素轴系统发生抗炎作用进而对儿童抽动反复发作起到抑制作用[17]。而豆甾醇与β谷甾醇可以增加肠道菌群的丰度，促进肠道双歧杆菌和乳酸杆菌的生长[18]。由此可知，健脾止动汤的主要成分与肠道菌群对神经递质及免疫的影响具有一致性，故推测健脾止动汤的主要成分可能通过调节肠道菌群进而调控神经递质与免疫系统抑制抽动症状。

PPI网络和分子对接结果发现健脾止动汤治疗儿童多发性抽动症的关键靶点是FOS、IL-6、SLC6A4。FOS是一种即刻早期反应基因，在生长因子、神经递质等作用下，FOS可即刻、短暂表达，作为传递信息的第三信使。FOS免疫反应作为纹状体中棘状神经元激活的替代标记, 在D1表达的中棘神经元中被上调[19]。研究发现产生刻板印象的精神刺激物的剂量优先上调FOS，可能导致刻板印象和抽搐[20]。IL-6编码一种细胞因子，其在炎症和B细胞的成熟中起作用。临床研究表明，儿童多发性抽动症组IL-6浓度显著高于健康人，且儿童多发性抽动症组抗病毒抗体和抗核抗体阳性的患儿明显增多，表明多发性抽动症患儿的免疫活性发生了改变[21]；体外研究证实IL-6可以影响DA的代谢，认为神经系统和免疫系统的细胞间可通过直接接触传递或通过产生并释放出来的生物活性因子进行信息之间的联系[22]。SLC6A4基因编码一个完整的膜蛋白，可将神经递质5-HT从突触空间转运到突触前神经元，具有终止5-HT的作用。有研究表明该基因启动因子中的重复长度多态性影响5-HT的摄取速率[23]，敲除小鼠SLC6A4基因后会发生类似抽动动作[24]。

KEGG通路富集分析发现，健脾止动汤的治疗作用可能与神经活性配体受体相互作用、多巴胺突触、5-羟色胺能突触、胆碱能系统等多种神经递质信号通路，及PI3K-Akt信号通路、催乳素信号通路有关。神经活性配体受体相互作用信号通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的配体的集合，与神经功能关系最为密切；神经递质在神经元间或神经元与靶细胞间起信号传递作用，研究显示儿童多发性抽动症主要与DA、5-HT及氨基酸类等神经递质异常有关[25]，现已证实假丝酵母菌、链球菌、大肠杆菌和肠球菌能产生5-HT，乳酸杆菌可调控多巴胺能通路改善抽动症状[8-9]；研究表明，胆碱能信号通路、PI3K-Akt信号通路及催乳素信号通路可能通过调节DA功能改善抽动[26-28]，现已证实乳酸杆菌可以通过迷走神经调控大脑内 GABA 的表达[29]，而GABA可以激活 PI3K-Akt信号通路[30]。另外，胆碱能通路还可激活磷酸化的JAK2及STAT3，从而使肿瘤坏死因子α、IL-6 等炎症介质减少，调节免疫减少抽动症状[31]，研究表明肠道菌群也可通过胆碱能通路影响脑组织中炎症因子分泌，进而影响脑认知功能[32]。由此表明肠道菌群可以通过脑肠轴调节多巴胺突触、5-羟色胺能突触、胆碱能系统等多种神经递质信号通路，及PI3K-Akt信号通路抑制抽动症状。

综上所述,本研究以中医理论为指导，基于网络药理学及分子对接技术，从肠道菌群出发，方证相应，揭示了健脾止动汤可能通过槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇等成分，作用于FOS、IL-6、SLC6A4等靶点，调节肠道菌群进而调控多种神经递质，抑制炎症反应从而治疗儿童多发性抽动症。本课题组在前期研究儿童多发性抽动症与神经递质的关系上，进一步探析了健脾止动汤通过脑肠轴治疗儿童多发性抽动症的物质基础、分子机制。本研究与目前儿童多发性抽动症的基础研究成果相一致，表明研究结果具有较高的参考价值。后续可以从肠道菌群入手，以槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇等成分及多巴胺突触信号通路、5-羟色胺能突触信号通路、胆碱能系统信号通路、PI3K-Akt信号通路为切入点，开展深入研究，为健脾止动汤治疗儿童多发性抽动症的实验设计及进一步研究提供思路和方法。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。