南极篮状真菌抑菌活性发酵产物分离与鉴定

王玥 陆园园 邢莹莹*

（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 211100）

微生物能产生不同的次级代谢产物，次级代谢产物大多是分子结构比较复杂的化合物。这些活性多样，结构新颖的化合物可作为药物的先导化合物。人们已经从微生物次级代谢产物中发现万余种次级代谢产物，可用于临床的微生物药物已经达到百余种[1]。其中真菌更是世界上与人类保持长久而密切的关系的第二大生物种群。南极地区环境与其余微生物生存的地方很不同，因此南北极地区被认为是潜在、重要的微生物资源库，也是产生新型生物活性物质和先导化合物菌株的潜在种源地。相对于温带与热带地区的中温性微生物资源,极地海洋微生物的生物多样性及药用价值仍旧缺少系统深入的调查研究。有极端气候的南极地区发现的微生物分泌的次级代谢产物对比气候温和的微生物分泌的次级代谢产物来说有不同的结构与功能活性，或许能成为药物重要的先导化合物，是人们还未研究透彻的课题[2]。分离培养方法的改进、功能基因研究、代谢调控、新的筛选模型等新的研究方法手段的引入，也将为极地微生物的药用研究提供更广阔的研究空间[3]。为了进一步以南极真菌的特殊代谢为基础，为抗菌药物的筛选提供更多的先导化合物，本文对分离自南极海洋淤泥的5.8S rDNA 序列为蓝状菌属的真菌SP-9 的发酵产物进行了分离纯化共得到六个化合物，并对其抑菌活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

真菌SP-9 由中国药科大学海洋药学教研室保存。体外抗菌检测用的菌株由实验室保存提供。

1.1.2 培养基

马铃薯蔗糖培养基（PDA）:SIGMA-ALDRICH 公司；马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）:SIGMA-ALDRICH 公司；Luria-Bertani 培养基（LB）:SIGMA-ALDRICH 公司。浅层芝麻固体培养基：50 m L 玻璃锥形瓶中加入50 g 大米和50 mL水，121℃灭菌20 min。浅层大米固体培养基：50 mL 玻璃锥形瓶中加入50 g 大米和50 mL 水，121℃灭菌20 min。

1.1.3 试剂

试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 发酵

1.2.1.1 菌株活化

将甘油保存的菌株SP-9 接种到PSA 培养基上，放入28℃培养箱中恒温培养7 天。

1.2.1.2 种子液的制备

挑取菌株SP-9 PSA 培养基上活化的单菌落接种到装有50 mLPDA 培养基的150 mL 锥形瓶中。培养条件：28℃，180 r/min，时间3 天，得到SP-9 种子液，种子液为均一培养液。

1.2.1.3 固体静置发酵

每50 g 芝麻/大米固体培养基中接入5 mL SP-9 种子液，摇匀后于28℃恒温光照培养箱中静置培养30 天后萃取发酵产物进行进一步分离纯化与活性测定。

1.2.2 分离纯化

菌株SP-9 芝麻固体发酵产物经乙醇萃取，减压浓缩后获得的粗品经大孔树脂色谱柱，洗脱后的水：乙醇(40%-80%）组分合并为Fr.2 后进硅胶柱，按氯仿：甲醇梯度洗脱后得到组分90:1（Fr.2-1）、80:1（Fr.2-2）、70:1（Fr.2-3）、60:1（Fr.2-4）、50:1-10:1（Fr.2-5）。组分Fr.2-2（氯仿:甲醇80:1），经ODS 色谱柱以及Sephadex LH-20 凝胶凝胶色谱柱得到化合物1（5 mg）、化合物2（10 mg）和化合物3（12 mg）。组分Fr.2-3（氯仿:甲醇70:1），经ODS 色谱柱以及高效液相制备（溶剂甲醇:水1:1，v/v，tR=27 min）得到化合物5（6 mg）。组分Fr.2-4（氯仿: 甲醇60:1）经ODS 色谱柱以及Sephadex LH-20 凝胶柱色谱（甲醇）得到化合物6（5 mg）。

菌株SP-9 大米固体发酵产物经乙醇萃取，减压浓缩后获得的粗品进硅胶色谱柱按氯仿: 甲醇洗脱得到组分90:1（A）、80:1（B）、70:1（C）、60:1（D）、50:1-10:1（E）。组分B（氯仿:甲醇80:1）进硅胶H 色谱柱得到化合物3（42 mg）。组分D（氯仿:甲醇60:1）进硅胶H 色谱柱得到化合物4（31 mg）。

1.2.3 活性测试

抑菌实验采用96 孔板联合酶仪检测最低抑菌浓度（MIC）值。将幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎双球菌（Streptococcus pneumonia）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）分别制成一定浓度的菌悬液（1×105CFU/mL）。

将化合物样品稀释为一系列浓度梯度后，分别设置实验组(100 mL 菌液+100 mL 样品)、阳性药组(100 mL 菌液+100 mL 阳性药)、调零组（200 mL LB 培养基）、空白对照组（100 mL 菌液+100 mL LB 培养基），每孔设置三个重复。28℃恒温培养24 个小时后检测OD600，公式[1-（实验组-调零组）/空白对照组]计算抑制率大于80%的最低样品浓度可视为最低抑菌浓度（MIC）。对测定数据进行统计学处理，采用Students' t-test 比较法。

2 结果

2.1 化合物结构鉴定

化合物1:1H-NMR (123 MHz, DMSO-d6) δ: 6.84(2H, dd, J1=18.1, J2=26.0 Hz), 6.75 (1H, s), 6.44 (1H, s),5.97 (1H, s), 5.85 (1H, d, J=11.8 Hz), 4.86 (1H, d, J=4.9 Hz), 4.60 (1H, d, J=5.1 Hz), 4.33 (2H, d, J=4.9 Hz),4.08-4.15 (2H, m), 3.20 (3H, d, J=4.6 Hz), 2.52 (1H, s).13C-NMR (125 MHz, DMSO- d6) δ: 149.2, 147.8, 146.9,146.7, 140.2, 136.0, 120.6, 119.9, 108.5, 107.0, 106.0,101.3, 101.0, 98.0, 85.0, 81.3, 72.2, 71.3。

以上数据与 Trowitzsch-Kienast W 等报道的(+)-Episesamin 数据[4]基本一致，确定化合物1 为(+)-Episesamin。

化合物2:1H- NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 7.58(1H, dd, J1=10.0, J2=2.5 Hz), 7.50 (1H, s), 7.0 (1H, d, J=8.2 Hz), 6.93 (1H, d, J=10.0 Hz), 6.85 (2H, dd, J1=8.0,J2=19.0 Hz), 5.95 (2H, s), 4.68 (1H, d, J=11.3 Hz), 4.11(2H, m), 4.00 (1H, dd, J1=5.3, J2=7.37 Hz), 3.47 (2H, m),3.40 (2H, s), 2.52 (2H, s).13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 198.0, 152.1, 148.4, 147.7, 147.0, 136.1,131.4, 125.4,120.3, 108.6, 108.3, 108.2, 107.2, 102.6, 101.3, 83.3, 70.6,60.2, 53.6, 49.6, 40.5, 40.3, 40.2, 40.1, 40.0, 39.8, 39.7,39.5。

以上数据Chiung YM 等报道的Sesaminone 数据[5]基本一致，确定化合物2 为Sesaminone。

化合物3:1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 7.51 (1H,td, J1=8.0, J2=8.0, J3=1.4 Hz),7.25 (2H, dd, J1=1.0, J2=7.8 Hz), 7.16 (3H, td, J1=8.0, J2=8.1, J3=1.0 Hz), 7.14 (2H, dd,J1=1.2, J2=8.0 Hz), 4.04 (1H, s), 3.26 (3H, s).13C-NMR(125 MHz, CD3OD) δ: 167.7, 166.0, 132.6, 131.7, 130.2,129.2, 129.0, 128.2, 127.1, 126.1, 125.5, 120.8,77.3, 77.0,76.8, 70.3, 64.9, 31.5。

以上数据与刘军亮等报道的Cyclopenin 数据基本一致[10]，确定化合物3 为Cyclopenin。

化合物4:1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 8.44 (1H,s), 7.55 (1H, td, J1=7.0, J2=7.0, J3=2.0 Hz), 7.25 (2H, dd,J1=7.8, J2=1.0 Hz), 7.17 (1H, dd, J1=1.7, J2=7.8 Hz), 7.14(1H, td, J1=8.0, J2=7.0, J3=1.0 Hz), 7.04 (1H, t, J=7.8 Hz),6.76 (1H, dt, J1=2.0, J2=7.0, J3=8.0 Hz), 6.26 (1H, t, J=1.8 Hz), 4.56 (1H, s), 4.13 (1H, s).13C-NMR (125 MHz,CD3OD) δ: 166.0, 165.5, 157.1, 135.1, 132.6, 131.1, 129.0,127.3, 124.7, 117.1, 115.7, 112.5, 70.3, 64.6, 30.3。

以上数据与刘军亮等报道的Cyclopenol 数据基本一致[10]，确定化合物4 为Cyclopenol。

化合物5:1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 1.02 (3H, s),1.14 (3H, s), 2.50 (2H, m), 4.09 (1H, dd, J1=10.5, J2=6.5 Hz), 5.00 (1H, s), 5.10 (2H, m), 5.66 (1H, s), 6.03 (1H, m),6.57-7.20 (6H, m), 7.66 (1H, s), 11.02 (1H, s), 11.81 (1H,s).13C-NMR (125 MHz, CDCL3) δ: 165.53, 158.47, 150.38,143.59, 137.51, 135.17, 128.93, 128.84, 126.69, 125.26,118.83, 117.13, 114.54, 108.97, 104.94, 78.03, 77.29,77.04, 76.78, 61.62, 59.14, 40.97, 37.23, 23.01, 22.50,0.02。

以上数据与Scott PM等报道的Isoroquefortine C 数据基本一致[11]，确定化合物为Iso-roquefortine C。

化合物6:1H-NMR (500 MHz, CDCL3) δ: 10.22 (1H,s), 5.10 (1H, s), 7.73 (1H, s), 6.40 (1H, s), 6.07(1H, m),5.70 (1H, s), 5.28 (1H, s), 5.04 (1H, dd, J1=10.0, J2=8.0 Hz), 4.12 (1H, dd, J1=8.0, J2=2.0 Hz), 2.58 (2H, m), 1.17(3H, s), 1.06 (3H, s).13C-NMR (125 MHz, CDCL3) δ:167.2, 159.5, 150.0, 143.3, 136.8, 135.1, 129.1, 128.6,125.5, 125.2, 121.9, 119.2, 114.8, 111.3, 109.2, 78.4, 77.3,77.1, 76.9, 61.5, 58.8, 40.9, 36.8, 22.9, 22.5。

以上数据与Scott PM 等报道的roquefortine C 数据基本一致[12]，确定化合物为roquefortine C。

2.2 化合物的抑菌活性

与同浓度的阳性对照药物卡那霉素相比，化合物1 对鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）的生长有明显抑菌作用，化合物2、5、6 对藤黄微球菌（Micrococcus luteus）有明显的抑菌作用，化合物1、3 对大肠杆菌（Escherichia coli）和绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）有明显抑菌作用（表1）。

表1 化合物1-6 的抗鲍曼不动杆菌、抗大肠杆菌、抗金黄色葡萄球菌、抗肺炎双球菌、抗绿脓杆菌、抗藤黄微球菌活性

3 讨论

在本次研究中，我们从来自南极海洋淤泥的篮状真菌SP-9 的芝麻固体光照发酵产物中提取得到四种化合物。化合物1，2 分别为芝麻相关物质d- 表芝麻素[4]和芝麻酮[5]，具有抗氧化[6]，抗炎[7]，抗肿瘤[8]等活性。因为d- 表芝麻素本不存在于芝麻中[9]，无法直接从芝麻中提取得到，猜测这种芝麻衍生物的生成和产量可能与南极淤泥真菌SP-9 的存在有关，而芝麻酮经过发酵产量可能得到提升[5]，这些猜想还待进一步研究。化合物3，4 分别为圆弧菌素和圆弧菌醇[10]，此前研究发现可以抗炎[11]。化合物5，6 分别为异烟棒曲霉素C 和异烟棒曲霉素C 的3，12 双键异构体[12-13]，此类化合物具有抗革兰氏阳性细菌活性[14]。此次研究此次研究发现化合物1 对鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）的生长有明显抑菌作用，发现化合物5、6 对藤黄微球菌（Micrococcus luteus）有明显的抑菌作用，化合物1 和3 对大肠杆菌（Escherichia coli）和绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）有明显抑菌作用。这些活性化合物均是第一次在南极淤泥中分离的篮状真菌SP-9 中发现，具有多种生物活性，为药物的筛选和设计提供了良好的参考。

但是，受到分离纯化得到的这些化合物量有限，在本研究中未能对其体内活性以及其余多种活性作用机制的研究，对真菌产生这些化合物的发酵过程也没有深入研究。在后续的实验中将会分离更多的化合物并对活性进行深入研究。