广州地区鲍曼不动杆菌的多位点序列分型及流行克隆

郭伟鸿 潘楚芝 黄慕超 方昌全 郭鹏豪 陈惠玲 赵子文 李裕军

1 广州市第一人民医院/华南理工大学附属第二医院呼吸与危重症医学科(广州 510180) 2 中山大学附属第三医院肝胆外科(广州 510630) 3 广州新海医院呼吸内科(广州 510000) 4 广州红十字会医院呼吸内科(广州 510220) 5 中山大学附属第一医院检验科(广州 510080)

鲍曼不动杆菌的克隆传播是一个世界性难题[1- 5]。由于具有强大的获得抗生素耐药性的能力，鲍曼不动杆菌导致的院内感染也被认为是最难以控制和治疗的情况之一[1, 6- 7]。因此，当务之急是加强对鲍曼不动杆菌传播的流行病学研究和监测。既往研究[8- 9]显示鲍曼不动杆菌CC92在中国流行且主要为ST92。后续研究发现ST75可能是东部地区[10]最常见的ST, ST138可能更多见于西部[11]。最近我们的研究显示ST195可能是广州地区的主要ST，而且没有检测到ST92[12-13]。另一项研究[14]也表明，ST195和ST365是广州两家医院的主要STs。综上，ST195而不是ST92在中国广州可能更常见。然而，这些研究受到单一中心或小样本量的限制，还需要更多的数据支持。因此，为进一步明确广州地区的流行克隆，本研究对广州地区5家教学医院的138株鲍曼不动杆菌进行分子流行病学分析，为疾病的进一步防控提打下基础。

1 材料与方法

1.1 菌株的采集与鉴定

收集2011年4月—2016年4月广州地区5家教学医院(广州市第一人民医院、中山大学附属第一医院、中山大学附属第三医院、广州市红十字会医院和广州新海医院)临床分离的非重复鲍曼不动杆菌。利用Vitek 2 (bioMerieux, Inc.， Durham, NC，美国)自动微生物学系统进行菌株鉴定。标准质控菌株:大肠埃希ATCC 25922, 铜绿假单胞菌ATCC 27853，由广州市第一人民医院微生物室提供。

1.2 MLST分型及eBURST分析

根据Bartual[15]报道，MLST具体操作如下：对7个管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD进行扩增和测序。将得到的序列通过Pubmlst数据库[16]分配为序列类型(STs)。eBURST算法(版本3)[17]被用于评估遗传关系，通过将STs归类为克隆复合体(CCs)，定义在7个基因座中，≥6共享等位基因的群体。CC由一个预测的祖先型ST及起源于祖先型的其他密切相关的ST共同组成。本研究所用引物序列见表1。

表1 本研究所用引物及其用途[17, 20]

2 结 果

2.1 138株鲍曼不动杆菌的分布

广州市5所教学医院来自广州市中心地区。广州市第一人民医院和中山大学附属第一医院位于越秀区; 中山大学附属第三医院位于天河区; 广州新海医院和广州市红十字会医院位于海珠区。这三个区集中了广州地区大部分医疗资源，具有代表性。138株鲍曼不动杆菌中来自广州市第一人民医院的66株，来自中山大学附属第一医院的32株，29株来自广州市红十字会医院，6株来自中山大学附属第三医院，5株来自广州新海医院。大多数菌株(55.8%，77/138)来自重症监护病房(ICU)，其次是急诊科(8.7%，12/138)，呼吸科(8.0%，11/138)和烧伤科(5.8%，8/138)，但各个医院有其独特的模式。与其他医院相比，除ICU外，广州市第一人民医院以呼吸内科患者较多(12.1%，8/66)，而中山大学附属第一医院以神经内科患者较多(12.5%，4/32)。广州市红十字会医院大部分患者来自急诊科(34.5%，10/29)。呼吸系统(72.5%，100/138)是鲍曼不饱和杆菌最常见的感染部位，其次是血液(14.5%，20/138)和伤口(6.5%，9/138)。比较各医院的鲍曼不动杆菌，中山大学附属第一医院的血液标本鲍曼不动杆菌比例较高(40.6%，13/32)，广州市第一人民医院的呼吸道标本较多(83.3%，55/66)，广州市红十字会医院的伤口标本较多(24.1%，7/29)。

2.2 菌株的MLST分型

138株鲍曼不动杆菌被分为25个ST型，其中ST195(等位基因谱1- 3- 3- 2- 2- 96- 3)49株，ST208(等位基因谱1- 3- 3- 2- 2- 97- 3)29株，ST457(等位基因谱1-15- 3- 2- 2-153- 3)15株，ST136(等位基因谱1- 3- 3- 2- 2-16- 3)12株，ST254(等位基因谱21-15- 3- 2- 35-111- 4)3株，ST548(等位基因谱1-15- 3- 2- 2-157- 3)2株，ST445(等位基因谱1-17- 3- 2- 2- 96- 3)1株，ST533(等位基因谱1-15- 3- 2- 2-16- 3)1株。此8个型是数据库里已有基因型，占菌株的81.2%(112/138)，其中ST195型最为常见，占菌株的35.5%(49/138)，在四家医疗中心广泛流行，广泛分布于ICU、内科、外科、急诊及神经科。其次较多见的为ST208型，占菌株的21.0%(29/138)，分布也比较广泛。ST445型只见于外科病房，而ST254、ST548、ST533及ST457型则主要分布于内科系统及ICU。

此外还发现17个新的ST型，分别为STn1(等位基因谱1- 3- 3- 2- 2- 96- 5)1株，STn2(等位基因谱1-15- 3- 2- 2- 96- 3)7株，STn3(等位基因谱1- 81- 3- 2- 2- 96- 4)2株，STn4(等位基因谱21-15- 3- 2- 35-G1- 3，其中G1为新发现的gpi位点的等位基因，其与gpi 111的差别在于第3个碱基的T→C突变)2株，STn5(等位基因谱A1-15- 3- 2- 2-153- 4，其中A1为新发现的gltA的等位基因，其与gltA 1的差别在于第156位碱基的A→C突变及159位碱基的A→C突变)1株，STn6(等位基因谱11- 65- 3- 20- 37- 96-15)1株，STn7(等位基因谱1-15- 3- 2- 2- 202- 3)1株，STn8(等位基因谱1- 3- 3- 2- 2-153- 3)2株，STn9(等位基因谱62-129-141- 7- 52- 96-10)1株，STn10(等位基因谱22-15-13-12- 4-163- 2)1株，STn11(等位基因谱1-1-13-12- 33-178- 41)1株，STn12(等位基因谱1- 3-141- 2- 2- 96- 3)1株，STn13(等位基因谱62-104-141- 7- 52- 96-10)1株，STn14(等位基因谱1- 34- 80- 28- 35-144- 45)1株，STn15(等位基因谱1- 3- 2- 28-1-107- 32)1株，STn16(等位基因谱33- 31- 2- 28-1- 96- 5)1株，STn17(等位基因谱62-100-138- 7- 52-11- 75)1株。在新发现的ST型中，STn1、STn2、STn6和STn16主要分离于ICU，STn3只见于神经外科，STn5、STn8和STn17见于外科病房，STn4、STn6和STn7见于内科病房。

2.3 菌株的亲缘关系分析

eBURST分析将138株菌株分2个主要克隆群(表2和图1A)， CC195包括ST136、ST195、ST208、ST445、ST457、ST533、ST548、STn1、STn2、STn5、STn7、STn8和STn12，其中ST195为预测的祖先型；CC2包括STn9和STn13。STn254、STn3、STn4、STn6、STn10、STn11、STn14、STn15 、STn16和STn17为独特型(Singletons)。我们进一步将138株菌株与MLST数据库225株中国菌株(数据下载于2017年3月22日)进行联合eBURST分析，结果显示CC92仍是我国流行最广，其祖先型为ST92。但是我们发现，广州地区的流行克隆是由CC92衍生出的一个新的亚克隆 CC195(图1B)。

表2 138株鲍曼不动杆菌eBURST分析

图1 鲍曼不动杆菌分离株的亲缘关系分析注：圆圈代表STs，它们的大小对应分离株的数量。 A：本研究138株鲍曼不动杆菌的eBURST分析，蓝色圆圈代表创始人ST (ST195)，黑色虚线表示克隆复合物(CC) 195。B：根据Pubmlst数据库截至2017年5月22日的数据，本研究138株鲍曼不动杆菌和数据库中现有分离株的联合eBURST分析，红色圆圈代表预测祖先型ST92，黑色虚线表示CC92，蓝色虚线表示CC195。ST标签的颜色代表的意义如下：黑色表示只存在Pubmlst数据库的STs；绿色表示仅在本研究中发现的STs； 紫色代表Pubmlst数据库和本研究中均发现的STs。

3 讨 论

鲍曼不动杆菌已成为全球医疗机构院内感染防控最棘手的病原体之一。由于鲍曼不动杆菌具有强大的耐药和克隆传播能力，迫切需要识别其潜在的宿主和传播方式来控制其传播。目前，广州地区的数据非常有限，流行克隆尚不明确。因此，据我们所知，本研究是广州地区少有的多中心流行病学研究，为该地区进一步制定个体化的院内感染防控策略提供依据。

参与研究的教学医院分布于广州市的越秀、天河区、海珠区，这些中心城区占有广州地区超过70%的医疗资源，研究结果具有代表性。本研究显示，鲍曼不动杆菌多见于ICU，且大多数分离自呼吸道标本，这与既往的研究[1,4，10-11]是类似的，提示ICU是鲍曼不动杆菌克隆传播的主要场所，是院内感控工作的重点区域。此外，本文也发现鲍曼不动杆菌的来源在不同医院之间也存在专科间的差异，这是与不同医院的专科设置及收治病种的差异相关。因此，应根据不同单位的实际，制定个体化的院内感染防控策略。

既往也有零星研究探索广州地区鲍曼不动杆菌的主要流行株，2013年广州的单中心研究显示ST208是主要的基因型，占分离株的54.2%[18]。随后本文提出不同观点，即广州地区ST195可能更常见。而本次多中心数据印证了本文观点，即主要基因型为ST195，占分离株的35.5%，而ST208型只占到分离菌株的21.0%。新近的几项研究也支持本文观点，一项2018年的研究显示莱芜市某三甲医院鲍曼不动杆菌主要基因型为ST195，占分离株的52.9%[19]。安徽地区的多中心研究也显示ST195是主要的基因型其占菌株的32.6%[20]。另一项研究[21]发现广州ICU环境鲍曼不动杆菌分离株最常见的基因型是ST195，占分离株的48.7%，由于环境株往往是导致患者感染的来源，进一步证实本文数据的准确性，即ST195是广州地区临床分离鲍曼不动杆菌的主要基因型。

确定了主要基因型，进一步利用eBURST分析探寻流行克隆，发现CC195是五家医院中的流行克隆(图1A)， 其中ST195是CC195的祖先型，提示目前CC195在广州地区广泛流行。有趣的是，ST195是ST92的单位点变异，而既往认为ST92为CC92的祖先型 (图1B)，CC92被认为是中国多个省份的流行克隆[8- 9]。然而，本研究没有检测到ST92。同样，ST92在其它来自中国[19- 22]和南非[23]的研究中也未检测到。此外, 其它研究也表明，ST195、ST208、ST365和ST191(而不是ST92)是中国各地医院最常见的STs[12, 14, 22]。本研究ST92缺失的一个解释是ST195由ST92进化而来，对该地区医院环境有了更强的适应能力。在进化过程中，更有优势的ST195可能会逐渐取代ST92或者其它ST型而成为主导，最近来自国内安徽[20]及莱芜市[19]的研究发现ST195为主要基因型，也支持这种假设，但需要进一步研究证实。在亲缘性分析中也可以看出，CC195实际上是一个从CC92派生出来的新的子CC(图1B)。这些结果表明，鲍曼不动杆菌CC195对医院环境具有较强的适应性，是广州地区的流行标志。