一种改良后的大脑皮质神经元细胞的原代培养模型建立及鉴定

张磊，韩延峰，戴朝，李阳，胡玉奇，陈富雷，赵冬*

(1 石河子大学医学院第一附属医院神经外科，新疆 石河子 832000；2 新疆生产建设兵团第十师疾病预防控制中心，新疆 北屯 836000；3 新疆生产建设兵团第十师北屯医院,新疆 北屯 836000)

原代大脑皮质神经元细胞已经成为科研人员研究神经科学的必备实验工具[1-2]，被广泛应用到神经系统疾病和药物作用的研究机制中[3]。然而，通过查阅文献发现[4]虽然国内外现有的培养神经元的模型很多，方法也渐进成熟，但是大多还是采用胰酶消化皮层组织。神经元与其它细胞相比，培养技术要求更高，实验过程操作更为繁琐，神经元娇嫩脆弱易受多重因素影响而死亡，现行的方法还存有些许的瑕疵，导致神经元生长环境中混有较多的细胞碎片和杂质细胞，使得培养板背景模糊，视野不明朗，严重干扰后续显微观察和荧光拍照等实验的有序进行。因此，我们实验室吸取了前辈们的大量经验，经过反复的试验摸索，参考Beaudoin等人[5]、Giordano等人[6]和杨传豪等人[7]的试验方法，选用新生SD乳鼠皮质，在原有方法基础上将Trypsin替换为Tryple Express和DnaseI混合消化液，将吸管吹打法置换成弹拨分散、手法震荡的方式，并经过提前一次离心后获得单细胞悬浮液，发现改良后获取的细胞纯度更高(>95%)，存活率更高，背景更干净，杂质及细胞碎片含量更少，且生长状态良好，双极神经元形态典型。此外，改良后的皮层神经元培养结果稳定可靠，可为神经系统疾病和药物作用的研究提供参考保障。

1 材料与方法

1.1 材料

原代皮质神经元来源于健康新生24 h内出生的SD乳鼠，购自于新疆动物中心。多聚赖氨酸(Sangon,ShangHai)，Neurobasal (Gibco,USA),2% B27 (Gibco,USA),Glutamax (Gibco,USA)，青链霉素(Hyclong,USA)，10% FBS(Gibco,USA)，NSE(Abcam,USA)，FITC(Zsbio,BeiJing)，PI(Sigma,USA)，Tryple Express(Gibco,USA) DnaseI(Sigma,USA)LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所)，HBSS缓冲液，PBS缓冲液，常规显微解剖器械两套，解剖显微镜，荧光显微镜(OLYMPUS IX73 Japan)。

1.2 方法

1.2.1 六孔板的包被

用双蒸水将多聚赖氨酸配制成0.1 mg·mL-1，经0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后加入到六孔板中，以完全覆盖六孔板为准，37 ℃温箱内放置6～8 h或4℃过夜，用之前用PBS冲洗2遍，晾干后避光待用。

1.2.2 溶液的配制

皮质神经元的培养液：Neurobasal+2% B27+10% FBS+ 1% Glutamax+青链霉素，混匀后4 ℃保存备用。混合消化液 1×Tryple Express+0.2 mg·mL-1DnaseI。

1.2.3 SD乳鼠大脑皮质神经元提取及培养

取24 h内出生的健康SD乳鼠6～8只，-20 ℃冰箱内冷冻麻醉15 min后，75%乙醇梯度消毒3遍后用PBS梯度冲洗3遍，在超净台内取出乳鼠的端脑，放置在预冷的HBSS液中(所有操作都在冰板上操作)。在显微解剖镜下分离出大脑皮质并去除血管和软脑膜，将剔除干净的皮层组织放入盛有预冷的HBSS液中，显微剪刀快速碎裂成0.5 mm3大小的颗粒后装入15 mL的离心管中，以1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清后加入5 mL预冷的HBSS液，同时加入等体积的1×Tryple Express 5 mL，和1 mL的DnaseI，混匀后放入37 ℃温箱内消化20 min，期间轻摇晃动3次。20 min后组织细胞浑浊呈现为稀薄的米汤状，用70 μm的细胞过滤器过滤两遍，收集滤液后再次以1 000 r·min-1离心5 min，弃上清后加入适量的神经元培养液。用弹拨分散、手法震荡的方式混匀细胞后，以4×106的密度种植在预先用多聚赖氨酸(PLL)包被的六孔板内，种植后的第4 h全量换液1次，以后每隔1日1次全量换液(全量换液均为事先配制好的神经元培养液)。

1.2.4 免疫荧光鉴定

将培养第7 d生长状态良好的皮层神经元从培养箱中取出，吸去培养液用PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，再用PBS洗3遍后，用0.1% Triton-x100透化皮层神经元20 min，用PBS洗3遍，用5%的脱脂牛奶封闭缓冲液30 min，弃去封闭液后加入一抗NSE(1∶100)抗体4 ℃孵育过夜，第2 d用PBS洗3遍后，与FITC偶联的二抗孵育2 h，细胞核用PI染色，抗荧光淬灭剂封闭盖玻片后用荧光显微镜观察。

1.2.5 乳酸脱氢酶(LDH)测定

按照LDH试剂盒说明书对LDH释放量进行检测，神经元细胞培养7 d后，收集六孔板内的培养液按说明书上的加样顺序，在酶标仪上测量吸光度值，根据公式计算LDH的漏出率。

1.3 统计学方法

所有统计计算均使用SPSS 22.0进行统计分析，数据采用均值±标准差表示，组间均数比较采用t检验,P值小于0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 皮质神经元细胞提取方法改良前后收获细胞数量的对比

在选取分离大脑皮质组织总量基本一致的条件下，相比传统方法(Method 1)改良后的方法(Method 2)能明显减少神经元细胞受损，从而使皮质神经元细胞数量明显增加(图1A～D、F)。

2.2 皮质神经元细胞的生长状态

皮质神经元接种到六孔板后，大部分神经元细胞迅速沉底，约15 min左右，几乎所有神经元已沉底但贴壁不牢。接种4 h后显微镜下可见神经元均匀地生长在六孔板中，神经元体积较小，少数神经元突起变长；第1 d后，胞体变大呈圆形，大部分细胞显示出了典型的双极神经元形态，1个细长的轴突和1个短粗的树突；第3 d，神经元形态基本成熟，变成了梭形或锥形，体积明显增大，突起变长逐渐弯曲，彼此相互连接交织成复杂的神经元网络；第5 d时，神经元饱满透亮，立体感增强，突起交联充分，形成更大且更复杂的神经网络，网络纵横交错促使胞体紧密聚拢，可以看到部分神经元紧密抱团的现象。第6、7 d细胞状态更加成熟，形态变化不明显，可用于相关实验(图1A～D、F)。而采用原方法培养后观察：第1 d后，约有半数细胞显示出了神经元的形态，但是典型的双极形态特征较为模糊；第3 d,神经元形态变成了梭形或锥形，彼此间相互连接交织形成的神经元网络不够紧密，还有部分相对孤立的神经元存在；第5 d，神经元立体感增强饱满透亮，形成了较为复杂的神经网络，典型的神经元紧密抱团现象数量不多，交联不够充分，纵横交错紧密聚拢度不够强烈；第7 d，细胞形态略显成熟，形态变化不明显，视野下观察网络交织紧凑茂密充盈度上存有些许间隙。原方法(Method 1)的缺点表现是：接种细胞的六孔板背景模糊，细胞周围环境中存有过多的碎片杂质，细胞形态相貌不规整，整体分布不均一，神经元的典型特征不突出(图1E)。而改良后(Method 2)接种细胞的六孔板背景干净透彻，碎片杂质少，神经元形态饱满立体感强，生长分布均匀，神经元典型的双极形态特征明显，还可见到神经元抱团现象(图1A～D、F)。

A：第1天；B:第3天；C:第5天；D:第6天 (Method 2)；E:第6天 (Method 1)；F:第7天图1 原代大脑皮质神经元在不同培养时间的形态学(× 200)

2.3 皮质神经元的纯度鉴定

采用2种方法获得皮质神经元细胞，用相同的培养基和培养环境培养7 d，免疫荧光染色法对比，结果显示：皮层神经元的轴突和胞浆经NSE染色后发绿色荧光，细胞核经PI染色后发红色荧光，两种免疫荧光的共存表现皮层神经元占所培养总数的比值，提示Method 2的细胞纯度更高(>95%)(图2D～F)，而Method 1方法获得神经元细胞纯度明显不如Method 2(图2A～C)。而且，用免疫荧光法所拍摄到的图片，Method 2中神经元的典型双极形态特征极为逼真，背景也极为干净(图2D～F)。

NSE和PI免疫荧光染色显示皮质神经元占培养细胞总数的比例,Method 1 (A、B、C)，Method 2(D、E、F)图2 NSE双重免疫荧光染色的典型显微图像(×400)

2.4 皮层神经元细胞的质量和存活率

乳酸脱氢酶(LDH)会由受损的细胞中漏出到培养液中[8]，细胞受损程度与测得的LDH的值呈正比[9]。因此，我们应用LDH活性的比色测定方法[10]。结果发现：采用相同培养基和培养环境下种植7 d后收取培养液测定LDH漏出率，Method 1与 Method 2相比较，有明显统计学差异(P<0.05)(图3),再次证明Method 2方法培养的皮质神经元细胞质量和生存率高。

方法1与方法2对比*P<0.05图3 两种方法测得乳酸脱氢酶的释放

3 讨论

一只乳鼠的两个皮层大约可收集到400万个神经元，它已成为科研人员研究神经科学的必备实验工具[11-13]。本实验采用一种全新改良的神经元提取方法，在原有方法基础上对组织细胞分离消化，弹拨分散、手法震荡，提前一次离心维持神经元的活力等步骤进行了改进，获得的皮质神经元细胞总数量明显增多，通过对细胞形态学观察和对纯度的鉴定以及细胞质量和存活率的综合评定后发现，改良后的提取方法能帮我们获得高收率、高纯度、高质量、低死亡率、背景干净的皮质神经元细胞，为后续神经科学领域的基础研究提供了理想的模型工具。

目前，对原代神经元提取的方法主要是采用传统的含EDTA的 Trypsin对脑组织进行消化处理[14]。获得的神经元细胞数量较少，质量和纯度不高，细胞存活率相对较低，背景模糊不清，含有较多的杂质和碎片。这些均对后续的实验研究造成了一定的影响，尤其是需要拍照的免疫荧光和免疫组化的相关实验。另外，Trypsin是一种动物源性的消化酶，制造生产的批次规格不同，稳定性很难得到规整性的统一，而且它还需要特异性的抑制剂使其灭活，这些都对神经元的提取和消化过程中产生影响，对神经元造成损伤，给实验带来干扰。改良后我们用Tryple Express代替Trypsin，同时在其中加入DnaseI酶，Tryple Express是非动物源性的重组酶，纯度比Trypsin更高，明显减少了Trypsin提取物中其它酶引起的细胞损伤，也是Trypsin的最佳替代品[15]。DnaseI酶可以辅助消化缠绕的DNA碎屑，利于神经元从团块中分散并由粘稠絮状鼻涕样的状态转变为稀薄的米汤状，方便后续的过滤和离心。这种混合液也明显减少了坏死细胞经裂解后释放出的DNA联系的缠绕，增加了皮层组织与混合物的接触面积，极大地提高了消化速率，终究获得了损伤较小数量较多纯度较高的神经元细胞。

查阅国内外文献，极少有报道提取原代皮层神经元过程中在组织消化前就进行1次离心的操作，而在改良的提取操作中，我们在消化前对已剪碎成0.5 mm3的皮层组织进行了1次离心，目的是清除在剥离剪碎皮层组织流程中存留的细胞碎片、软脑膜及渗入到脑组织的血细胞等杂质，进而获得更高纯度的皮层组织进入下一消化环节。另外，改良后我们采用弹拨分散、手法震荡的方式替代使用吸管吹打的方法。神经元的提取培养中吹打和消化是两个非常重要的因素，吹打力度因人而异不好掌控，吹打过度细胞受损严重，活力下降，死亡数量增多，组织碎片也会增多导致背景不干净；吹打不足，因组织团块缠绕紧密，不能很好的解离疏散并被充分的消化，所获细胞数量较少纯度也不高，同时还会产生过多的干扰性气泡。而我们利用食指和中指顺时针性的弹拨盛有皮层组织的离心管时，可以使组织碎液从底部形成漩涡状的水柱，这种水柱产生的涡旋性的外力柔和而平稳能够充分混匀浆液，对细胞的外力损伤明显降低，气泡产生的机会也得到了缓控，显著提高了消化效率。经过上述步骤的改良，也是我们实验过程中获得高数量和高纯度的神经元细胞的重要因素。

当然要想培养出理想的神经元细胞，一些细节性的问题也是决定成败的关键。比如我们提前用PLL包被六孔板使神经元更好的贴壁，经过多次尝试我们发现分子量为7～15万的PLL效果更好；在Neurobasal培养液中加入2% B27可明显提高神经元培养的纯度[16]；选择种植的第4 h作为换液的关键时间点，因为在这个时间节点全量换液能够最大程度的清除坏死细胞和组织碎片等杂质，以后每隔一日一次全量换液并在显微镜下观察细胞生长状态拍照保存；另外大多数文献报道，种植神经元细胞的密度为≥7×105或≥1×106(6孔板)[17],在我们的实验中发现种植密度为≥4×106较为合适，因为神经元在长出轴突和树突时容易抱团聚集，密度稍高所形成的网络结构更加密集，这更有利于提供和传递神经元存活的营养物质和促进神经元良好的发育[18-19]，另外Western blot等试验本身对神经元数量需求就比较多，以上细节均值得借鉴。

总之，本实验在组织细胞分离消化，弹拨分散、手法震荡，提前1次离心，多重细节方面进行了探索与改良，通过对皮质神经元形态学观察、免疫荧光鉴定、细胞数量、存活率、LDH实验等获得了高收率、高纯度、高质量、低死亡率、背景干净的皮质神经元细胞，也为神经科学领域提供了理想的模型。