电针百会穴对脾虚泄泻模型大鼠影响的研究

周 轲，牛 淳，刘文娟，姚万玲，纪 鹏，华永丽，魏彦明

(甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070)

脾虚泄泻是指因脾阳气虚而致运化失常、作泻，多表现为腹泻、久泻不愈、时泻时止或完谷不化、食欲不振、消瘦或乏力等[1]。兽医临床上，脾虚泄泻多因饲养寒凉食物、饥饱失常、过度使役、环境性应激等造成，为兽医临床常见病证之一，通常会导致动物食欲低下，消化不良，使动物体重下降，抵抗力降低继发其他疾病，严重者可导致死亡，对畜牧业生产造成一定的经济损失。

动物百会穴的定穴与人不同。人的百会穴定于后发际正中上7寸，两耳尖直上头顶正中[2]，而动物的百会穴定于腰荐十字处，即最后腰椎与第一荐椎棘突间的凹陷中，但都处于督脉循行路线上。动物百会穴主要用于治疗腰胯疾病[3]。据文献报道，白针或水针百会穴对腰胯损伤、后肢麻痹及马的破伤风有一定的治疗效果[4-6]。但有关针刺百会穴治疗家畜脾胃泄泻等疾病的研究鲜有报道，仅王鲁等[7]电针百会穴来进行抗腹泻试验，发现电针百会穴对治疗仔猪腹泻具有良好疗效。脾虚泄泻多与消化道中下部有密切联系，而消化道中下部与百会穴解剖位置较接近，利用近治取穴的原则[3]，可选取该穴治疗脾虚泄泻。其次督脉可督一身之阳气，脾虚泄泻时中阳不健、运化无权，针灸督脉之穴，可扶正机体阳气。因此百会穴可作为治疗脾虚泄泻的重要穴位。

本研究用灌胃番泻叶的方法建立脾虚泄泻动物模型，以电针百会穴的方法进行治疗，通过观察临床症状，测定脾、胰的器官指数及检测胃肠吸收能力和炎症因子变化情况来评价电针百会穴对脾虚泄泻的治疗作用，为兽医临床治疗脾虚泄泻提供一种方便快捷的针灸治疗方法，也为进一步研究百会穴的功效以及发挥功效的机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料与试剂

1.1.1 试验药品 番泻叶购自兰州惠仁堂药业银滩雅苑店，处理方法：将1 kg番泻叶加入到5 L沸水中，浸泡30 min，纱布过滤得到浸泡液，将浸泡液用蒸馏水定容至5 L，得到质量浓度为0.2 g·mL-1的番泻叶浸液。浸液置于4 ℃冰箱备用。天然蒙脱石散(生产批号：F25551)购自博福-益普生(天津)制药有限公司。

1.1.2 试验试剂 D-木糖试剂盒(货号：A035)购自南京建成生物工程研究所，D-木糖(货号：SX8030)购自索莱宝科技有限公司，大鼠淀粉酶ELISA试剂盒(货号：ml059302)、大鼠IL-12 ELISA试剂盒(货号：ml622111)均购自上海酶联生物科技有限公司，大鼠IL-2 ELISA试剂盒(货号：ERC001.96)、大鼠肿瘤坏死因子-α ELISA试剂盒(货号：ERC102a.96)均购自欣博盛生物科技有限公司。

1.1.3 试验仪器 YP502 N电子天平(上海天美天平仪器有限公司)，BSA224S-CW分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，KWD-808I脉冲电疗仪(常州市武进长城医疗器械有限公司)，Spectra Max Plus384酶标仪(美谷分子仪器有限公司)，752 N紫外分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物分组 64只Wistar大鼠，雌雄各半，体质量180～200 g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，合格证号SCXK(甘)2021-0001，室温自然光照环境，标准饮食，自由饮水。适应性饲养3 d后分成假手术组(sham operated group，Sham)，百会组(electric acupuncture Baihui group, Baihui)，模型组(model group，Model)和阳性对照组(positive control group，PC)。

1.2.2 动物模型建立及治疗 造模方法在徐海珍等[8]、周鸿雲等[9]、彪雅宁等[10]基础上加以改良调整。模型组、百会组、阳性对照组分别在中午12：00和晚上24：00各灌胃1次番泻叶浸液(0.2 g·mL-1)，按体质量以10 μL·g-1计算用量；假手术组灌胃相应体积(按体质量以10 μL·g-1计)生理盐水。第5天，造模各组大鼠普遍出现腹泻、粪便稀溏、精神萎靡等症状，提示造模成功。造模成功后，仍按照上述方法持续灌胃番泻叶浸液至第18天。百会组从第5天开始，每天早上9：00—11：00，将其固定在大鼠固定架上，并电针百会穴(刺入深度为3～5 mm，针尖5 mm处缠绕透明胶带，保证入刺深度趋于一致)连续波刺激，基础电强度为2级，其余调为4级左右，以大鼠微微颤抖为标准，针刺激15 min。阳性对照组灌胃蒙脱石散悬浊液(浓度为40 mg·mL-1，用量20 μL·g-1)。假手术组和模型组每天在大鼠固定架上固定15 min直至第19天。

1.2.3 样本采集 第18天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，第19天解剖前1 h灌胃5% D-木糖2 mL。水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，置于室温制备血清，-80 ℃保存备用；采血致死后剖取脾、胰腺。

1.2.4 一般行为学观察 试验中每天观察大鼠的一般状态，如精神状态、活动状态、生长体态、被毛、饮食欲、肛周、粪便等，并加以记录。

1.2.5 腹泻指数 记录奇数天每只大鼠出笼1 min内的排便次数及稀便等级。计算方法根据国际通用标准，腹泻指数=稀便率×稀便等级。稀便率按照稀便次数/排便次数来计算。稀便等级按照稀便最小直径分为4级，小于1 cm为1级，1～2 cm为2级，2～3 cm为3级，稀便最小直径大于3 cm的为4级。

1.2.6 体质量测定 奇数天对大鼠进行称重，称重需在拉尾排便试验结束后，去除排便减重的干扰，对大鼠进行3次体质量的测量，取平均值。

1.2.7 脏器指数的测定 摘取脾、胰腺，剔除多余结缔组织，用分析天平测定其质量。计算脾及胰腺的器官指数。计算公式：脏器指数=器官质量/动物体质量×100%。

1.2.8 血清AMS和D-木糖的检测 取出-80 ℃下保存的血清，室温下解冻，严格按照试剂盒的说明，进行AMS和D-木糖检测。

1.2.9 血清炎性因子的测定 取出-80 ℃下保存的血清，室温下解冻，严格按照试剂盒说明，进行血清IL-2、IL-12及TNF-α的测定。

2 结 果

2.1 一般行为学变化

造模前，所有大鼠精神状态良好、活泼好动，被毛光滑洁白，食欲良好，粪便成型，肛周洁净。试验第13天(治疗一周后)，模型组大鼠体型消瘦，神情呆滞，被毛杂乱，不愿走动，排水样稀便，稀便常黏附于肛周及尾巴，百会组一般行为学表现有所好转，肛周污秽减少，粪便湿润。阳性对照组粪便稀软(图1)。而百会组和阳性对照组大鼠状态逐渐恢复，通过2周的治疗，百会组和阳性对照组一般行为学与假手术组趋于一致。

图1 第13天各组大鼠的腹泻情况

2.2 电针百会穴对脾虚泄泻动物体质量的影响

与假手术组相比，从第3天开始，模型组雄性大鼠体质量变化率在奇数天均显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)；雌性大鼠在第9、13天模型组的体质量变化率显著降低(P<0.05)。与模型组相比，从第11 天开始，百会组雄性大鼠体质量变化率奇数天均显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)；雌性大鼠变化不显著(P>0.05)。从电针百会穴第1天起，百会组和阳性对照相比雌雄大鼠体质量变化率均差异不显著(P>0.05)(图2)。

A.雄性大鼠体质量变化率；B.雌性大鼠体质量变化率；模型组与假手术组相比，*.P<0.05，**.P<0.01；百会组与模型组相比，#.P<0.05，##.P<0.01

2.3 电针百会对脾虚泄泻动物稀便及腹泻指数的影响

从第5天起，模型组、百会组和阳性对照组均出现了持续性腹泻症。与假手术组相比，其他三组的腹泻指数显著升高(P<0.05)(图3A)。第13天时，电针和药物治疗1周后，与模型组相比，百会组腹泻指数极显著降低(P<0.01)，而阳性对照组和模型组差异不显著(P>0.05)(图3B)。第19天时，相较于模型组，百会组和阳性对照组腹泻指数均极显著降低(P<0.01)(图3C)。

2.4 电针百会穴对脾虚泄泻动物胰腺和脾指数的影响

与假手术组相比，模型组的脾指数极显著升高(P<0.01)，胰腺指数显著降低(P<0.05)；与模型组相比，百会组和阳性对照组的脾脏指数极显著降低(P<0.01)，胰腺指数显著升高(P<0.05)(表1)。

表1 各组雌性大鼠的脾、胰腺指数

2.5 电针百会穴对脾虚泄泻大鼠消化吸收功能的影响

与假手术组相比，模型组血清D-木糖含量极显著降低(P<0.01)，阳性对照组的D-木糖含量显著降低(P<0.01)。与模型组相比，阳性对照组血清中D-木糖含量显著升高(P<0.05)，百会组血清中D-木糖含量极显著升高(P<0.01)。与阳性对照组相比，百会组血清中D-木糖的水平显著上升(P<0.05)(图4A)。与假手术组相比，模型组淀粉酶含量显著降低(P<0.05)；与模型组相比，百会组和阳性对照组淀粉酶含量均显著上升(P<0.05)(图4B)。

A.D-木糖；B.淀粉酶。与假手术组相比，*.P<0.05，**.P<0.01；与模型组相比，#.P<0.05，##.P<0.01；百会组与阳性对照组相比，+.P<0.05

2.6 电针百会对脾虚泄泻动物血清炎性因子的影响

与假手术组相比，模型组IL-2含量极显著升高(P<0.01)，与模型组相比，百会组和阳性对照组的IL-2含量均极显著降低(P<0.01)(图5A)。与假手术组相比，模型组IL-12含量显著升高(P<0.05)，与模型组相比，百会组IL-12含量显著降低(P<0.05)，阳性对照组IL-12含量极显著降低(P<0.01)(图5B)。与假手术组相比，模型组TNF-α含量极显著升高(P<0.01)，与模型组相比，百会组和阳性对照组TNF-α含量均显著降低(P<0.05)(图5C)。百会组和阳性对照组的血清IL-2、IL-12和TNF-α均差异不显著(P>0.05)(图5)。

A.IL-2；B.IL-12；C.TNF-α。与假手术组相比，*.P<0.05，**.P<0.01；与模型组相比，#.P<0.05，##.P<0.01

3 讨 论

百会穴在兽医上常用来治疗腰胯损伤，后肢麻痹等；人医临床中，此解剖部位穴位多用于治疗妇科疾病，如月经不调、疼痛等病症。关于针刺此穴治疗泄泻报道较少。中兽医临床上对脾虚泄泻常用参苓白术散或其衍生方来治疗，针灸治疗通常选取后三里、脾俞为主穴，以及脾、胃经络的穴位为配穴[11]。作者前期预试验研究发现，电针后三里、脾俞、百会穴对脾虚泄泻治疗效果确切。而百会穴相较于其他穴位定穴简单、操作简便、不易溜针，更适合应用于临床治疗。作者通过电针百会穴的确切疗效可对临床治疗脾虚泄泻的针灸疗法，提供一定的选穴依据。

本研究中，脾虚泄泻大鼠表现出食欲降低，腹痛，触摸后闪躲，精神萎靡，四肢无力，尤以腹泻次数增加，排水样稀便，肛周黏附粪便污渍，被毛杂乱无光泽等症状为主。百会组电针百会穴治疗1周后大鼠食欲明显改善，精神状态稍有好转，活动范围增大且腹泻次数明显降低。治疗2周后，状态与假手术组接近。从症状体征上来看，成功建立了大鼠脾虚泄泻模型，且电针百会穴可以缓解脾虚动物的临床症状。脾虚泄泻对大鼠体质量也具有重要的影响。徐俊[12]曾把体质量下降定义为脾虚泄泻模型建立成功的标志，脾虚泄泻动物体质量下降是因为大鼠食欲下降，采食量降低；另外腹泻造成肠胃蠕动加快，营养物质吸收不良，致体质量降低。但本试验结果表明，脾虚模型组雄性大鼠全程和第9与13天的雌性大鼠体质量增长率下降，与该报道结果不完全一致。雌性大鼠体质量没有全程增长率下降，这可能是由于不在雌鼠生长发育最明显阶段或雌鼠天然抵抗力较强或其他因素导致。因此，脾虚泄泻的判定仅靠体质量下降不够全面，应考虑性别原因，并结合其他症状体征综合判断。

腹泻指数因其能很好地描述动物个体腹泻情况，常用作评价腹泻程度的国际指标[13]。本试验前期动物出现了大范围腹泻，电针百会穴治疗1周后(第13天)，百会组的腹泻指数较模型组明显下降，表明电针百会穴对腹泻起到了一定的缓解作用。治疗2周后(第19 天)，腹泻指数降为0，表明电针百会穴可有效缓解脾虚泄泻大鼠腹泻症状，这与施旭光等[14]、肖怡等[15]报道的脾虚泄泻模型建立后及药物治疗后腹泻指数变化趋势一致。

中(兽)医学的脾包括现代解剖学中的脾和胰腺[16-17]。本研究结果显示，脾虚泄泻时，会导致雌性大鼠的脾指数显著增大，胰腺指数显著减小，这与蔺晓源等[18]报道的脾虚泄泻动物脾增大相一致。说明脾、胰功能及形态发生了改变，这可能是由于脾虚泄泻时炎性细胞浸润而使脾发生了代偿，胰腺指数下降可能是由于胰腺发生萎缩，这与本研究中胃肠消化吸收功能减弱相一致。本研究未选用雄性大鼠的脏器指数数据是由于雄性大鼠体质量变化过大，脏器指数测量大多依赖体质量而发生偏差，导致测量结果不准确。通过电针百会穴降低了脾指数，提升了胰腺指数，从而恢复了脾和胰腺的功能状态，进一步说明电针百会穴对脾虚泄泻具有一定的治疗作用。

多数学者认为D-木糖吸收试验是一种重要且灵敏度较高的检查胃肠吸收的方法[19-20]。主要是因为D-木糖吸收部位在小肠，其代谢不需要消化酶的参与，经肾以尿液形式排出体外[21]。脾胃虚弱时小肠细胞膜表面的Na-K-ATP酶活性降低，小肠黏膜的吸收功能下降导致吸收D-木糖的能力降低[22]。AMS广泛存在于唾液和胰腺中，发生脾虚泄泻时，淀粉酶活性降低而导致消化不良[23]。本研究结果显示，脾虚泄泻模型组大鼠D-木糖及AMS水平降低，可能是由于泄泻导致肠道吸收水平降低，而百会组D-木糖及AMS水平升高，说明电针百会穴上调了D-木糖及AMS水平，恢复了肠道的吸收功能。这与黄娟等[24]、张明等[25]关于脾虚泄泻动物体内D-木糖及AMS变化结果一致。

脾虚泄泻的产生通常伴随炎症因子的变化[26]。孙胜振等[27]发现使用苍术和白术配伍对脾虚泄泻动物体内炎性因子有较好的改善作用。长期腹泻会损伤肠黏膜，引起机体产生炎症反应，释放炎性因子，导致机体内促炎因子水平升高[28]。IL-2能活化T细胞，促进细胞因子产生，并激活巨噬细胞，调节肠道炎症环境。IL-2、IL-12都是促炎因子，IL-12可以促进TNF-α的释放[29]。TNF-α在肠道中促进炎症的发生，充当黏膜损伤介质并导致肠黏膜细胞结构的变化[30]。本试验结果表明，电针百会穴可能是通过抑制了IL-12的表达水平，导致TNF-α水平降低，抑制了炎症反应，从而缓解脾虚泄泻模型动物体内炎症反应，以治疗脾虚泄泻。

4 结 论

成功建立了脾虚泄泻大鼠模型，电针刺激百会穴对脾虚泄泻具有一定的治疗效果，主要表现为缓解脾虚泄泻的症状体征，增加体质量，缓解腹泻，增强肠道消化吸收功能，降低机体的炎性反应。这为临床治疗脾虚泄泻提供一种方便快捷的针灸方法，并为研究针刺百会穴可以治疗脾虚泄泻提供证据支持。