卵巢早衰病人血清微小RNA-125b表达及与中医证型的相关性分析

李海霞，李慧朋，王文文

作者单位：郑州市第七人民医院，a妇科，b中医科，c药学部，河南 郑州450016；

卵巢早衰是临床常见的妇科内分泌疾病之一，也是引起卵巢储备功能异常的主要疾病之一，其发病趋势呈现明显年轻化［1］。卵巢早衰发病率占原发性闭经的20%～28%，约占继发性闭经的4%～20%，可导致生殖器萎缩，增加骨质丢失、心血管疾病发生风险，甚至造成女性丧失生殖能力，严重影响女性身心健康［2］。研究表明，卵巢早衰与卵泡数量减少有关［3］。有研究报道，微小RNA（miR）-125b 在多囊卵巢综合征病人卵泡中表达上调［4］，中枢性性早熟女童血清miR-125b 表达水平异常可用于评估乳房发育情况［5］。VICTORIA 等［6］研究证实，抗米勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）可在一定程度上反映卵巢功能，而卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）是临床常用卵巢早衰诊断检测指标［7］。由于血清miR-125b在卵巢早衰中表达水平报道较为少见，本研究旨在探讨卵巢早衰病人血清miR-125b 表达水平，通过分析miR-125b 表达与AMH、FSH/LH 及中医证型的关系，以期为卵巢早衰临床治疗提供一定理论帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017 年3 月至2019 年6 月郑州市第七人民医院妇科收治的136例卵巢早衰病人作为研究对象（研究组），研究组年龄（35.23±1.37）岁，范围为28～39 岁；体质量指数（23.01±0.83）kg/m2，范围为20～25 kg/m2；西医诊断标准参照曹泽毅主编《中华妇产科学》［8］（第三版）中诊断标准，中医诊断标准参照《中药新药临床研究指导原则》［9］制定的标准，其中中医辨证分型诊断标准主要参考《中医妇科学》［10］、《中医诊断学》［11］及《中药新药临床研究指导原则》［9］中分型标准：有肝肾阴虚证、肾虚肝郁证、脾肾阳虚证、肾虚血瘀证。

另选取同期120 例该院体检健康者作为对照组，年龄（35.45±1.46）岁，范围为26～39岁；体质量指数（23.09±0.85）kg/m2，范围为20～26 kg/m2，两组研究对象年龄、体质量指数比较，差异无统计学意义（t=1.24、0.76，P=0.215、0.447）。

1.2 纳入标准（1）符合上述卵巢早衰中西医诊断标准；（2）年龄<40 岁；（3）闭经超过4 个月；（4）至少2 次（间隔时间>1 个月）血清FSH>40 IU/L，雌二醇<73.2 pmol/L；（5）病人知情，签署知情同意书；（6）该研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.3 排除标准（1）近1 年有激素治疗史者；（2）伴多囊卵巢综合征及其他卵巢疾病者；（3）先天性生殖器官发育不全者；（4）伴严重心、肝、肾等器官原发性疾病者；（5）伴恶性肿瘤者；（6）泌乳素异常者；（7）甲状腺功能异常者；（8）伴糖尿病、高血压及血液疾病者；（9）精神疾病者。

1.4 样本采集及检验收集所有研究对象（未闭经者在月经期2～3 d，闭经者无时间限定）清晨空腹静脉血5 mL，室温静置1 h，3 000 r/min 离心10 min，分离上清，超低温冻存待检。（1）血清AMH 水平检测；（2）采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测血清miR-125b 表达水平，试剂盒购自大连宝生物技术有限公司。20 µL 反应体系如下：ROX 0.4µL，Mix 10µL，cDNA 2µL，正、反向引物各2µL，无酶水3.6µL。反应步骤如下：95 ℃，7 min，1循环；95 ℃，15 s；63 ℃，35 s；72 ℃，18 s；40 循环，一个样品3次重复。以U6为内参基因，采用2−ΔΔCt法计算miR-125b 表达水平；（3）采用酶联免疫吸附测定检测血清AMH水平，AMH试剂盒由美国Epitope Di‑agnostics 公司提供，全自动酶标仪购自意大利Bio‑base 公司，具体步骤参照试剂盒说明书操作；（4）采用电化学发光法检测FSH、LH 水平，试剂盒、化学发光分析仪购自美国雅培公司，室内质控数据均在控，由同一实验员完成上述检验操作。

1.5 统计学方法采用统计软件SPSS 23.0 处理实验数据，计量资料行正态检验，符合正态分布，采用±s描述，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较应用单因素方差分析（采用q检验进行两两间比较）；计数资料用（%）描述，采用χ2检验；采用Pearson 相关性分析检验血清miR-125b 与AMH、FSH/LH 比值关系，通过logistic 回归分析探讨血清miR-125b、AMH、FSH/LH 对卵巢早衰不同中医证型影响。当P<0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢早衰病人中医证型分布情况136例卵巢早衰病人中肾虚肝郁证56例（41.18%），肝肾阴虚证32 例（23.53%），肾虚血瘀证23 例（16.91%），脾肾阳虚证20例（14.70%），其他5例（3.68%）。

2.2 两组病人血清miR-125b、AMH、FSH、LH、FSH/LH 比值比较研究组病人血清AMH 水平明显低于对照组（P<0.05），miR-125b、FSH、LH、FSH/LH比值明显高于对照组（P<0.05），见表1。

表1 体检健康者与卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比较/± s

表1 体检健康者与卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比较/± s

注：AMH为抗米勒管激素，FSH为卵泡刺激素，LH为黄体生成素。

组别对照组研究组t值P值FSH/LH 1.05±0.31 1.62±0.52 10.48<0.001例数120 136 miR-125b 1.01±0.29 2.67±0.91 19.14<0.001 AMH/（pmol/L）10.95±2.62 1.98±0.64 38.65<0.001 FSH/（U/L）6.05±1.02 47.28±9.15 49.08<0.001 LH/（U/L）5.32±1.37 30.46±8.24 33.01<0.001

2.3 不同中医证型病人血清miR-125b、AMH、FSH、LH、FSH/LH 比值比较四组不同中医证型病人血清miR-125b、AMH、FSH、LH、FSH/LH 比值比较差异有统计学意义（P<0.05），肝肾阴虚证组病人血清AMH 水平低于肾虚肝郁证、肾虚血瘀证、脾肾阳虚证病人（P<0.05），脾肾阳虚证组低于肾虚血瘀证组（P<0.05）；肝肾阴虚证组病人miR-125b、FSH、LH 水平高于肾虚肝郁证、肾虚血瘀证、脾肾阳虚证病人（P<0.05），脾肾阳虚证组miR-125b、FSH、LH 水平高于肾虚血瘀证、肾虚肝郁证组（P<0.05）；肝肾阴虚证组病人FSH/LH 比值低于肾虚肝郁证、肾虚血瘀证病人（P<0.05），脾肾阳虚证组低于肾虚肝郁证病人（P<0.05）。见表2。

表2 不同中医证型卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比较/± s

表2 不同中医证型卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比较/± s

注：AMH为抗米勒管激素，FSH为卵泡刺激素，LH为黄体生成素。①与肾虚肝郁证比较，P<0.05。②与肝肾阴虚证比较，P<0.05。③与肾虚血瘀证比较，P<0.05。

组别肾虚肝郁证肝肾阴虚证肾虚血瘀证脾肾阳虚证F值P值FSH/LH 1.88±0.23 1.42±0.28①1.69±0.31①②1.58±0.36①19.62<0.001例数56 32 23 20 miR-125b 2.26±0.75 3.35±1.07①1.94±0.62①②2.73±0.93①②③15.94<0.001 AMH/（pmol/L）1.85±0.24 1.56±0.20①2.01±0.12①②1.72±0.28②③21.15<0.001 FSH/（U/L）43.28±5.11 52.95±3.26①42.73±4.51①②47.12±4.26①②③36.89<0.001 LH/（U/L）24.83±2.52 35.92±3.04①26.57±4.23①②30.79±4.34①②③82.34<0.001

2.4 卵巢早衰病人血清miR-125b 表达水平与AMH 水平、FSH/LH 比值相关性卵巢早衰病人血清miR-125b 表达水平与AMH 水平呈负相关（r=−0.470，P<0.001），与FSH/LH 比值呈正相关（r=0.502，P<0.001）。

2.5 卵巢早衰病人血清miR-125b、AMH、FSH/LH与中医证型的关系以miR-125b、AMH、FSH/LH 比值为自变量，中医证型为因变量，引入logistic 多元回归模型显示，血清AMH 与肾虚肝郁证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证呈负相关（P<0.05），miR-125b、FSH/LH比值与肾虚肝郁证、肝肾阴虚证、肾虚血瘀证、脾肾阳虚证呈正相关（P<0.05），见表3。

表3 卵巢早衰病人血清miR-125b、AMH、FSH/LH与中医证型的关系

3 讨论

3.1 卵巢早衰中医病机及证型分析祖国医学将卵巢早衰归属于“闭经”“不孕”“血枯”“绝经前后诸证”等范畴，《素问·上古天真论》最早提出“早衰”一词，其曰“今时之人不然也……以忘为常……故半百而衰也”，《素问·阴阳应象大论》亦有云：“能之七损八益……则早衰之节也。年四十而阴气自半化，起居衰也。”肾虚为卵巢早衰发病病机，《傅青主女科》有“经本于肾”“经水出诸肾”之说，肾藏先天之精，天癸之源，主生殖，肾精充足则天葵生化有源，肾气亏虚，精血匮乏，天癸竭，冲任虚衰，胞宫失所养。有学者认为卵巢早衰病机以肾虚为主，清心滋肾可取得较佳治疗效果［12］。本研究结果显示，136例卵巢早衰病人肾虚肝郁证（41.18%）、肝肾阴虚证（23.53%）、肾虚血瘀证（16.91%）、脾肾阳虚证（14.70%）4 类证型均见肾虚，与滕秀香等［13］研究结果相似，提示肾虚可能在卵巢早衰发病机制中占主导地位。

3.2 卵巢早衰病人血清miR-125b 及激素指标水平分析本研究结果显示，卵巢早衰病人miR-125b表达水平明显高于对照组，提示血清miR-125b表达水平升高可能与卵巢早衰发生有关。有研究发现，miR-125b 可通过与骨形态发生蛋白受体1B 特异性结合，促进绵羊卵巢颗粒细胞凋亡［14］。还有研究表明，miR-125b可通过靶向激活素受体2a调控新生小鼠卵巢原始卵泡形成［15］。而Chen 等［16］研究报道，miR-125b 过表达与卵巢细胞线粒体凋亡通路激活有关，上述结果均提示miR-125b可能通过调控卵泡相关基因表达，参与卵巢早衰发生过程。

进一步查阅文献发现，Lannes 等［17］研究认为，miR-125b 可通过神经激素调节LH、FSH 表达水平，参与神经元性疾病进展。AMH 与转化生长因子β（TGF-β）表达密切相关，有研究证实，胰腺导管腺癌进展中miR-125b 可与TGF-β 相互作用，参与癌细胞增殖、凋亡进程［18］。其中AMH 属于TGF-β 超家族，其主要表达分泌部位为初级卵泡的颗粒细胞，随卵泡增大而分泌减少，并随年龄增长呈降低趋势，在调控卵泡的生长发育中发挥重要作用［19］。李强等［20］研究发现，卵巢功能衰退病人血清AMH水平降低，对其早期检测可预测卵巢功能衰退。FSH 是卵巢早衰最敏感检测指标之一，临床上将FSH>40 IU/L 时视为卵泡耗竭，当卵巢功能异常时，血清FSH、LH 分泌调控会出现紊乱，与卵巢早衰发生密切相关［21］。本研究结果显示，较于对照组，研究组病人血清AMH 水平降低，FSH、LH 水平及FSH/LH 比值升高，与陈红男等［22］研究结果相似，提示血清AMH表达及FSH/LH 比值异常可能与卵巢早衰发生发展相关。本研究结果显示，卵巢早衰病人血清miR-125b 表达水平与AMH 水平呈负相关，与FSH/LH 比值呈正相关，进一步提示血清miR-125b可能通过与AMH、FSH、LH等相关指标或因子相互作用，促进卵泡数量减少及功能异常发生，共同参与卵巢早衰进展。

3.3 卵巢早衰中医证型与血清miR-125b 及激素指标的关系另外，本研究结果还显示，血清miR-125b、AMH、FSH、LH及FSH/LH比值在肝肾阴虚证、脾肾阳虚证病人中表达差异较为明显，提示血清miR-125b、AMH、FSH/LH 比值与卵巢早衰中医证型中肝肾阴虚证、脾肾阳虚证的关系较为密切。中医认为肾内藏真阴元阳，阳主动，为成熟卵子排出体内的动力所在，而肾阴则为卵子生成、成熟提供物质基础，肾虚日久，肾阴阳失调，肾阴不足可导致卵泡形成障碍，而肾阳不足则影响排卵，导致排卵功能障碍，影响卵巢功能，肝肾为母子关系，而脾肾共主水液代谢，影响卵巢分泌功能［23-24］。因此，肝肾阴虚证、脾肾阳虚证卵巢早衰病人血清miR-125b、AMH水平及FSH/LH 比值异常较明显。最后研究发现，血清AMH与肾虚肝郁证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证呈负相关，miR-125b、FSH/LH 比值与肾虚肝郁证、肝肾阴虚证、肾虚血瘀证、脾肾阳虚证呈正相关，提示血清miR-125b、AMH 表达、FSH/LH 比值与卵巢早衰中医证型相关，临床上可通过检测血清miR-125b、AMH 水平及FSH/LH 比值变化作为卵巢早衰中医证分型辅助指标，但是由于本研究仅从临床角度浅显地分析了二者之间的关系，后期将从分子生物学及基因组学等多个角度进行探讨中医药调控miR-125b对卵巢早衰的影响。

综上所述，卵巢早衰病人血清miR-125b 高表达，与AMH、FSH/LH 比值异常变化有关，且肝肾阴虚证、脾肾阳虚证病人血清miR-125b水平变化较为明显，与卵巢早衰中医证型相关，但是由于本研究对象较少，且卵巢早衰病程较长其主观症状随病情变化而变化，可能影响中医辨证分型，缺乏多中心研究，同时本研究仅从临床角度探讨血清miR-125b与卵巢早衰病人中医证型的关系，关于二者之间的内在机制以及是否存在中医药及基因调控miR-125b 尚不明确，还有待进一步从基础理论深入分析。