长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因4在胃癌中的表达及与预后的关系

谭莉霞，杨文义，闫春晓，王航宇，杨丙信，徐梦阳，武利萍

作者单位：河南大学第一附属医院消化内科，河南 开封475000

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，被认为是第四大最常见的肿瘤类型，也是全世界癌症相关死亡的第二大原因［1］。由于胃癌早期多无明显症状，大多数胃癌病例在诊断时已发展为晚期，很大概率地限制了治疗范围。因此，对胃癌发病机制的研究对改进预防策略、开发早期诊断及管理治疗方法是必要的。近年来，长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）在癌症中的作用越来越受到重视。研究发现，LncRNA 可参与调控基因转录及翻译进而参与多种癌症的发生发展过程［2-3］。小核仁RNA宿主基因4（small nucleolar RNA host gene 4，SN‑HG4）是一类小非编码RNA 分子，参与rRNAs、tRNAs、snRNAs 等其他RNA 的化学修饰［4］。最新研究报道称，SNHG4 表达上调与肝癌病人低生存率有关，是肝癌预后不良的独立预测因子［5］。Xu 等［6］研究发现，LncRNA SNHG4在骨肉瘤中高表达，且其表达水平与肿瘤大小及病人不良预后有关。上述研究表明LncRNA SNHG4 在多种癌症中差异性表达并对肿瘤进展起重要作用。本研究利用生物信息学方法通过iBio Tools v5.0 分析发现SNHG4 在胃癌中的表达水平明显升高，通过检测胃癌组织中Ln‑cRNA SNHG4 表达水平，分析其与病人临床病理参数及预后之间的关系，以期为临床诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015 年1 月至2016 年10 月于河南大学第一附属医院肿瘤科行手术根治术切除的113 例胃癌组织及82 例癌旁正常胃黏膜组织为研究对象。113 例胃癌病人中，男68 例，女45 例，年龄≥50 岁的66 例，<50 岁的47 例；临床分期Ⅰ～Ⅱ期42 例，Ⅲ～Ⅳ期71 例；低分化73 例，中高分化40 例；发生淋巴结转移79 例，未转移34 例。所有胃癌病人均经病理组织诊断确诊，均为首次治疗，术前未行放、化疗或其他抗肿瘤药物治疗，病人临床病理资料及随访资料完整。排除合并其他肿瘤病人及自身免疫性疾病病人。所有病人知情同意此次研究，本研究获得河南大学第一附属医院伦理委员会批准（20150213）。

1.2 方法

1.2.1 数据库来源 UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一个全面的癌症数据在线分析和挖掘的网站，是基于癌症基因组图谱（the can‑cer genome atlas，TCGA）分析和可视化目标基因的网站，可实现相关癌症基因生物标志物鉴定、表达图谱分析、生存分析等。本研究基于上述数据库，对SNHG4 在胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中表达差异进行比较。

1.2.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测LncRNA SNHG4 表达水平 首先按照Trizol 试剂盒（日本Takara 公司）说明书方法对胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织进行总RNA 的提取，利用逆转录试剂盒（美国Applied Biosystem 公司）将RNA 逆转录为互补DNA（cDNA），采用qRT-PCR 法检测LncRNA SNHG4 表达水平。qRT-PCR 反应体系共20 µL，其中SYBR Green qPCR Mix 10 µL，cD‑NA 2 µL，正、反向引物各1 µL，双蒸水6 µL。Ln‑cRNA SNHG4 以β 肌动蛋白（β-actin）为内参，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。LncRNA SNHG4 正向引物：5’-GCAGGTGA‑CAGTCTGCATGT-3’，反向引物：5’-TTTTA‑AGTCCCCTACCCCCATC-3’；β-actin 正向引物：5’-TGCTGTCCCTGTATFCCTCT-3’，反向引物：5’-TGATGTCACGCACGATTTT-3’。循环条件：95 ℃预变性2 min，90 ℃变性15 s，65 ℃延伸30 s，共40个循环。利用2−ΔΔCt法计算LncRNA SNHG4 相对表达水平。

1.3 随访所有胃癌病人术后均以电话或门诊形式进行随访，随访截止日期为2020 年10 月，随访时间范围为6～57 个月，中位随访时间21 个月，以病人死亡为随访终点事件。到随访日期结束，共计死亡72例，存活31例，失访10例，即72例发生终点事件。统计胃癌病人生存时间，绘制Kaplan-Meier 生存曲线，比较不同LncRNA SNHG4 表达水平病人生存情况。

1.4 统计学方法采用SPSS 25.0 软件进行数据的录入与分析。计数资料以例（%）表示；基于R 语言的survivalROC 包完成时间依赖性ROC 曲线绘制，同时通过约登指数获取用于生存分析分组的最佳阈值点。采用χ2检验分析LncRNA SNHG4 表达水平与胃癌病人临床病理参数的关系；生存分析采用Kaplan-Meier 法，组间生存曲线差异用log-rank 检验；多因素Cox 回归分析影响胃癌病人预后不良的危险因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 数据库分析SNHG4基因在胃癌组织及正常组织中的表达情况TCGA 数据库显示，SNHG4 基因在415 例胃癌组织中的表达水平为（1.95±0.62），明显高于其在34 例正常胃黏膜组织中的表达水平（0.43±0.12）（t=14.26，P<0.001）。

2.2 LncRNA SNHG4在胃癌组织及正常胃黏膜组织中的表达水平LncRNA SNHG4 在113 例胃癌组织中的表达水平为（1.67±0.64），明显高于其在82例癌旁正常胃黏膜组织中的表达水平（0.98±0.12）（t=9.63，P<0.001）。

2.3 胃癌组织中LncRNA SNHG4表达情况与病人临床病理参数之间的关系使用survivalROC 包绘制时间依赖性ROC 曲线，得到最佳截断值为1.816，故本研究以LncRNA SNHG4 水平是否大于1.816 将病人分为LncRNA SNHG4高表达组（>1.816）和低表达组（≤1.816）。结果显示，LncRNA SNHG4 水平高低与胃癌病人年龄、性别、肿瘤最大径、肿瘤位置无关（P>0.05），与病人临床分期、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结是否转移有关（P<0.05），见表1。

表1 胃癌组织中LncRNA SNHG4表达情况与病人临床病理参数之间的关系/例（%）

2.4 LncRNA SNHG4表达水平与胃癌病人生存时间的关系Kaplan-Meier 生存分析结果显示，Ln‑cRNA SNHG4 高表达组胃癌病人5 年累积生存率为28.85%，中位生存时间16.0 个月；LncRNA SNHG4低表达组胃癌病人5 年累积生存率为42.62%，中位生存时间27.0个月，log-rank检验差异有统计学意义（χ2=11.05，P<0.001）。

2.5 影响胃癌病人发生终点事件的单因素分析胃癌病人年龄、性别、肿瘤最大径、肿瘤位置与终点事件发生无关（P>0.05），临床分期、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移与终点事件发生有关（P<0.05），见表2。

表2 影响胃癌病人发生终点事件的单因素分析结果/例（%）

2.6 影响胃癌病人预后不良的多因素Cox 回归分析将临床分期、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况及LncRNA SNHG4 水平作为自变量进行多因素Cox回归分析，结果显示，临床分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、浸润深度T3～T4、淋巴结转移、Ln‑cRNA SNHG4高表达是影响胃癌病人预后不良的独立预测因素（P<0.05），见表3。

表3 影响胃癌病人113例预后不良的多因素Cox回归分析

3 讨论

胃癌的发生发展涉及多种基因共同作用，各个基因构成基因网络，通过调控肿瘤细胞增殖分化、迁移侵袭等生理病理过程参与胃癌进展各个阶段［7］。多项研究表明，基因的致癌作用主要是通过基因的转录和蛋白质编码实现的［8-10］。然而，最近研究发现，不到2%的人类基因组是编码基因，而超过90%的基因是在大多数系统中起调节作用的非编码基因，可在表观遗传修饰、转录和转录后等不同水平调控基因表达［11-12］。LncRNA 是一类长度超过200 bp 的功能性RNA 分子，由于缺失开放性阅读框而丢失编码蛋白功能，其在胃癌中的作用研究近年来成为热点。国内学者符伟玉等［13］通过细胞实验发现，利用LncRNA BC002811 构建的病毒载体在胃癌细胞中过表达，可提高肿瘤细胞的增殖能力。周士诚等［14］发现，LncRNA-C21orF96 在胃癌细胞中过表达能显著调控miR-875-5p 表达同时促进USF2 基因表达，促进胃癌细胞的侵袭和转移。另有报道称，LncRNA LOXL1-AS1 在胃癌组织和细胞中高度表达，其表达上调预示胃癌的预后不良，进一步研究发现LOXL1-AS1 通过诱导细胞增殖、迁移和上皮间质转化，加速胃癌肿瘤的恶化［15］。另有其他研究发现LncRNA 通过靶向调控miRNA 或蛋白表达，参与胃癌细胞的增殖、迁移等生理病理过程［16-17］。以上研究提示，多种LncRNA 参与胃癌的发展进程，然而LncRNA SNHG4在胃癌中作用尚缺乏研究。

随着研究的不断进展，LncRNA SNHGs 在消化道肿瘤中的作用越来越受到关注。SNHG1 作为SNORD22 的宿主基因，其位于染色体11q13，SNORD22 位于细胞核［18］。随后，SNHG3、SNHG5 等相继被报道。Wang 等［19］研究发现，SNHG7 在胃癌组织及细胞系中表达上调，体外实验证实抑制SN‑HG7 表达可明显抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡，细胞周期停滞在G1/G0 期，进一步研究发现SN‑HG7 可通过调节p15 和p16 表达部分参与胃癌的发生发展机制。本研究结果显示，LncRNA SNHG4 在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常胃黏膜组织，且其表达水平与病人临床分期、肿瘤分化程度、浸润程度、淋巴结是否转移有关，表明SNHG4在胃癌中呈高表达，可能发挥癌基因作用，并参与胃癌病人肿瘤细胞增殖、分化、迁移等病理过程，具体作用机制有待进一步体外细胞培养实验。Zhang等［20］利用TCGA 数据库评估了SNHG12 表达与胃癌病人临床病理特征及预后的关系发现，SNHG12 表达越高，肿瘤浸润深度越大，病人生存率越低；体外细胞实验发现SNHG12 通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/AKT 通路诱导胃癌的发生。本研究进一步分析SNHG4 水平与胃癌病人生存时间的关系，结果显示，LncRNA SNHG4 高表达胃癌病人5 年累积生存率明显低于低表达病人；多因素Cox 回归分析结果显示，临床分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、浸润深度T3～T4、淋巴结转移、LncRNA SNHG4 高表达是影响胃癌病人预后不良的独立预测因素，LncRNA SN‑HG4 高表达病人预后不良风险是低表达的2.045倍，提示LncRNA SNHG4 表达水平与胃癌病人预后有关，可能作为胃癌病人预后的独立预测因子。

综上所述，LncRNA SNHG4 在胃癌组织中表达升高，与病人临床分期、肿瘤分化程度、浸润深度及淋巴结转移有关，其高表达是胃癌病人预后不良的独立预测因素，可能为胃癌病人预后评估提供参考。本研究仅在临床病理方面分析了的LncRNA SNHG4 表达差异，具体作用机制有待进一步细胞实验研究及验证。