维生素A通过铁调节蛋白2基因表达来影响铁代谢

蓝岚 邹培斧 梁克纪

摘 要：目的：通过大鼠原代肝细胞培养（体外试验）来研究维生素A通过铁调节蛋白2（IRP-2）来影响铁代谢。方法：将SD大鼠原代分离肝细胞（seglent法），随机分组严重缺乏A、边缘缺乏B、常规组C、预防治疗组D、RO阻抑组E，分别给予0、0.5、1.0、50 μmol/L全反式视黄酸和50 μmol/L全反式视黄酸+10 μmol/L RO（RARα阻断剂）培养4 d。用RT-PCR法测量肝脏的IRP-2 mRNA的情况。结果：大鼠维生素A缺乏时，原代肝细胞表达IPR-2 mRNA水平增强（P<0.05），补充维生素A后， IPR-2 mRNA表达下降，但加入RO后，维生素A这种作用明显减弱了。结论：维生素A作为转录调节剂，可通过结合视黄酸细胞核受体（RARα），改变IRP-2转录水平，改变铁调节稳态，调节机体贫血状态。

关键词：维生素A;铁调节蛋白2

维生素A缺乏（vitamin A deficiency，VAD）和贫血仍然是我国最主要的营养素缺乏症，对我国学龄前儿童的健康影响极大，是亟待解决的公共卫生问题。维生素A为一种人体必需脂溶性维生素，人体不能合成，通过参与糖蛋白合成及抗氧化作用，对机体多项机能进行调节。维生素A的补充干扰细胞铁状态的调节，维生素A缺乏干扰铁代谢最终导致贫血是贫血主要发生原因之一，但其明确的干扰机制还不是很清楚。研究证明，细胞维持铁稳态重要的调节机制是铁调节蛋白2转录水平进而影响铁蛋白和转铁蛋白受体水平来调节铁的代谢[1-3]，本研究为验证维生素A能够通过结合视黄酸细胞核受体（RARα），进而诱导IRP-2转录的表达最终干扰铁代谢[4]，并通过进行受体阻抑试验，以进一步明确维生素A对铁转录调节的影响是通过RARα通路调节，为探讨维生素A缺乏导致缺铁性贫血的机制提供线索。

1 材料与方法

1.1 试剂

Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原酶、DMEM培养液等，购于Gibco BRL;RT-PCR试剂，大连宝生物工程有限公司;Ro41-5253（RARα选择性拮抗剂，Ro），Enzolifescience.Co，引物来自上海英骏生物技术有限公司等。

1.2 原代肝细胞处理、分离、诱导

SD大鼠21 d齡24只，饲料配方参考美国营养学会推荐的AIN-93G啮齿类试验动物饲料配方，并对其进行组分的调整，其中如营养素、能量能保证大鼠基本需要，但无机盐中剔除铁、维生素中剔除维生素A，共饲养8 w。试验前禁食12 h采用二步胶原消化法分离肝细胞[5]，将活力在95%以上的原代肝细胞（台盼兰）接种在胶原包被的培养皿内。加入培养液等待24 h后，将原代贴壁后的肝细胞皿随机分为5组：A组为维生素A严重缺乏组，培养液中只含有0.5%DMSO，没有atRA;B组是维生素A边缘缺乏，0.5 μmol/L atRA;C组为维生素A正常组，1 μmol/L atRA;D组为维生素A治疗剂量组，培养液中0.5%DMSO、50 μmol/L atRA;E组为阻抑组，培养液含50 μmol/L atRA、10 μmol/L Ro。所有培养液共有成分：肝细胞和表皮生长因子，10 %胎牛血清，青、链霉素（40万U/L）、胰岛素（100 mg/L）、地塞米松（0.4 mg/L）。培养4 d后的肝细胞消化收集。

1.3 肝脏mRNA检测

内参照为β-actin，IRP2，其中，β-actin（512bp）的上游为5′-GTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3′;下游为5′-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3′;IRP-2（459bp）上游为5′-GTTTGTCTCCAGGCAGTG-3′;下游为5′-ACCGTTTATTTCCCATCT-3′。PCR处理参数：94℃预变性4 min，变性94℃30 s，退火是55℃30 s，延伸为72℃50 s，35个循环。72℃10 min后，4℃冰箱暂存。PCR产物跑凝胶电泳（β-actin作为参考比较）[4]。

1.4 统计分析

采用SPSS16.0软件进行分析统计，多组整体比较采用随机设计方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以α=0.05作为检验标准。

2 结果与分析

2.1 原代肝细胞形态、活力及功能

倒置显微镜下，新鲜分离的肝细胞呈单个分散状态，圆形或球形，透亮，细胞核位于中央，试验证明短时间快速的灌注活性较好。肝细胞培养24 h后贴壁、伸展、核变清晰，少数活力差的细胞悬浮于培养液中，换液时可以去除。48 h后肝细胞紧紧粘附于培养板底壁，自动排列成肝索样结构，呈典型的上皮细胞样的多角形或者椭圆形形态，胞体变平变薄体积明显增大，可见许多双核细胞，开始出现岛状连接。这种良好的状态可维持到试验结束。

2.2 各组大鼠肝脏表达IRP-2 mRNA情况

A、B、C、D组随着维生素 A剂量的增加，IRP-2 mRNA呈表达下降的趋势（P<0.05）;但维生素A缺乏组和边缘缺乏组之间IRP-2 mRNA含量差异没有统计学意义（P>0.05）。D组IRP-2 mRNA的表达最低，A组最大，E组介于A、D之间（P<0.05）。可见，维生素 A缺乏可以使原代培养肝细胞IRP-2 mRNA的表达增强，补充维生素 A可使其表达降低，但在加入RO后，这种降低的表达作用又稍增加。

3 讨论

大量流行病学和临床观察试验证明，维生素A对细胞铁代谢有关系，本研究可为探讨大鼠缺乏维生素A加剧贫血提供分子生物学基础。维生素A（全反式视黄酸作为其天然代谢产物）通过其细胞胞内的结合蛋白-核受体（RARs、RXRs）及反应元件（RARE）参与作用调控很多种基因的表达来调节细胞代谢的特定功能，如激素、受体、效应器等[5-6]。另一方面，近年来又对细胞铁稳态调节相关基因有了初步的了解。分子细胞领域的铁稳态主要被几种核心蛋白调控，其数量直接关系到肝细胞铁代谢的稳定，保证在细胞需要时有铁供给，利用充足，但要避免铁过量引起毒性。调节细胞铁平衡的主要蛋白—铁调节蛋白2（IRP2）处于铁代谢的核心地位。IRP-2是一种调控细胞质RNA结合蛋白，具备转铁蛋白受体、铁蛋白mRNA的非翻译区的铁效应元件IREs结合能力，在mRNA水平控制这两种蛋白来调控哺乳动物细胞的铁代谢。IRP-2是铁稳态起关键作用的转录后调节因子，故本研究选择了IRP-2来研究[7-8]。

本研究证明，维生素A作为一种转录水平的调节剂，能够通过与视黄酸细胞核受体结合，激活视黄酸反应元件，诱导IRP-2 mRNA基因的表达最终调控铁代谢[9]。当机体维生素A缺乏时，肝脏作为储存器官，IRP-2 mRNA表达反而上调，结果使肝细胞从血中摄取、吸收、储存铁增多，使机体铁储存反而增加，利用减少，转运受阻，进而导致血液系统内铁含量降低，骨髓的铁摄取减少，最终导致贫血。这种作用在陈科[10]的研究中也得到证实。本研究认为，维生素A作为转录水平调节物，通过最终营养铁储备、动用产生效果。维生素A储备状况越好，机体铁动员效率越快，肝脏储铁越少，反之则加剧贫血的发生。但本研究不能完全排除维生素A可能通过调节其他代谢产物来干扰IRP-2的调控功能，因为除了以上核心途径，还有很多途径可以影响的IRP-2的活性，例如缺氧、氧化应激反应和EPO的生成等。

参考文献

[1]杨春，杨晓光.中国人群维生素A的影响因素[J].医学综述，2016，22（7）：1249-1252.

[2]俞春芝，赵现立，康瑛.妊娠期贫血发病的高危因素及对妊娠结局的影响[J].中国妇幼保健，2017，32（23）：5827-5830.

[3]金鹿，闫素梅，史彬林，等.维生素A抗氧化功能的机制[J].动物营养学报，2015，27（12）：3671-3676.

[4]Eisenstein RS.Iron regulatory proteins and the molecular control of mammalian iron metabolism[J].Annu Rev Nutr，2000（20）：622-627.

[5]王莹，张先杰，宋茂民，等.三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养及生物学特性的研究[J].首都医科大学学报，2007，28（1）：2017-2031.

[6]徐小磊，王朝旭，苏畅，等.维生素A缺乏对大鼠铁代谢影响[J].中国公共卫生.2008，24（10）：1225-1226.

[7]Dong Wei，Yi Yang，Weiping Wang.The expression of retinoic acid receptors in lymph nodes of young children and the effect of All-trans-Retinoic Acid on the B Cells from lymph nodes[J].Journal of Clinical Immunology，2007，27（1）：88-94.

[8]姜珊，王朝旭，姜丽英，等.维生素A缺乏对大鼠铁代谢影响[J].中国公共卫生.2011，27（10）：1271-1272.

[9]蓝岚，梁克纪，张羽飞，等.维生素A缺乏对缺铁性贫血的影响-体内外试验对比研究[J].中国食物与营养，2016，22（4）：62-64.

[10]陈科，章岚，罗红裔，等.维生素A补充对学龄前儿童铁代谢稳态的影响[J].中华预防医学杂志，2014，48（1）：18-22.

[11]蓝岚，邹培斧，梁克纪.原代肝细胞培养与动物试验对比研究维生素A缺乏对贫血的影响[J].中国食物与营养，2020，26（12）：59-61.

Effect of Vitamin A on Iron Metabolism by IRP-2 mRNA Pathway

LAN Lan1，2，ZOU Pei-fu3，LIANG Ke-ji4

（1 Shenzhen Baoan Authentic TCM Therapy Hospital，Shenzhen 518101，China;2 The Health Supervision Institute of Mudanjiang Municipal Health Bureau，Mudanjiang 157000，China;3 Dapeng District Women and Child Health Hospital，Shenzhen 518120，China;4 Dongguan Kanghua Hospital，Dongguan 523080，China）

Abstract：Objective To study the effect of vitamin A on IRP-2 expression in cultured primary rat hepatocyte.Ro41-5253，as retinoic acid receptor（RARα）selective antagonist，was used to confirm the role of RARα in effect of vitamin A on iron metabolism.Method SD rat primary hepatocytes were isolated by two-step in situ collagenase perfusion method by Seglent，were treated with 0，0.5，1.0，50 μmol/L atRA，and stimulated with RARα antagonist-Ro（10 μmol/L）+50 μmol/L atRA on group E.After 96 h，the expression on IRP-2 mRNA levels by RT-PCR were measured.Result Hepatic IRP2 mRNA levels were decreased by vitamin A supplementation，but the effect of vitamin A on IRP-2 mRNA can be diminished after adding retinoic acid receptor（RAR-α）selective antagonist.Conclusion Vitamin A deficiency can change IRP-2 mRNA expression by RARα.Vitamin A supplementation inhibited the increase in IRP-2mRNA expression.

Keywords：vitamin A;iron regulatory protein 2（IRP-2）

基金項目：国家自然科学基金“维生素A缺乏对铁代谢相关基因表达的影响研究”（项目编号：30872107）;黑龙江省自然科学基金“维生素A缺乏对铁代谢相关基因表达的影响研究”（项目编号：D200641）。

作者简介：蓝岚（1981— ），女，硕士，副主任医师，研究方向：传染病防控。