响应面法优化苦荞麸皮粉蛋白质提取工艺

吴兰兰 吴伟菁 王立博 李建华

摘 要：目的：分析苦荞麸皮粉中蛋白含量及其蛋白组成。方法：采用碱法提取-等电点沉淀分离蛋白。在单因素试验基础上，选取料液比（w/v）、pH、时间等3个影响因素，采用响应面法 （Box-Behnken 中心组合）优化苦荞麸皮粉蛋白提取工艺。结果：料液比、pH、时间对麸皮蛋白提率有显著影响，影响顺序为料液比> pH>时间。响应面优化得到最佳提取条件为pH 10.5、料液比1∶35、时间3 h 40 min，此条件下苦荞麸皮蛋白提取率为（97.31±4.64）%。结论：本研究为有效开发利用苦荞麸皮粉的蛋白提供科学依据。

关键词：苦荞麸皮粉;蛋白提取;pH;料液比;时间;响应面法

苦荞是一种功能性的粮食作物[1]，其蛋白含量为11.1%～12.2%[2-3]。苦荞蛋白具有抗氧化[4]、改善血脂代谢[5-7]、改善肠道菌群[8]、降低胆固醇[9-10]、降血压[11]等作用。苦荞麸皮为苦荞加工中的副产物，但其含有丰富的蛋白，含量为15.66%～25.3%[3，12]。谷物蛋白通常采用碱法提取—等电点沉淀获得，苦荞蛋白常用提取pH为8，但是存在蛋白含量不高的问题，纯度为42.9%～63.1%[9，10，13-15]。同时，苦荞蛋白中含有14.6%～55% 的谷蛋白[16-17]，苦荞球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白在pH=7.5时的溶解性均<20%[17]。因此，采用pH 8提取不能充分提取苦荞蛋白。研究表明，碱性提取pH值、料液比、提取时间、温度等條件对谷物蛋白含量、纯度和功能性的影响有差异。谷物蛋白提取率随着pH提高而提高[18]，但是碱性过高，尤其是pH 值为11～12会增加蛋白变性的程度[19-20]。本研究通过单因素试验，获取蛋白提取率影响显著的因素及范围，随后通过响应面法（Box-Behnken 中心组合）优化苦荞麸皮粉分离蛋白提取工艺，为有效开发利用苦荞麸皮粉的蛋白提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦荞粉、麸皮粉，由四川省凉山州螺髻山公司提供;考马斯亮蓝 G-250，国药集团化学试剂有限公司;牛血清白蛋白V，北京拜耳迪生物技术有限公司;盐酸、氢氧化钠、石油醚、氯化钠等试剂，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子天平（BSA224S），塞多利斯科学仪器北京有限公司;磁力搅拌器（JK-DMS），上海精学科学仪器有限公司;pH计，赛默飞世尔科技有限公司;多功能酶标仪（Infinite M1000），奥地利Tecan公司;水浴锅（HWS-24），上海一恒科学仪器有限公司;分析天平（SECURA），塞多利斯科学仪器北京有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦荞全粉及麸皮粉中蛋白质含量测定 苦荞中蛋白质含量测定采用GB 5009.5-2016 食品国家安全标准《食品中蛋白质含量的测定》[21]。

1.3.2 苦荞全粉及麸皮粉中Osborne蛋白组分的分离提取 参考Osborne植物4种蛋白分离法[16]，略作修改。以苦荞全粉、麸皮粉为原料，依次采用水、1 mol/L氯化钠、70%乙醇、0.05 mol/L氢氧化钠溶液，以1∶20（m/v）的比例提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白。每步提取30 min，并重复2次，离心（10 000 r/min，10 min）收集不同组分上清液。采用考马氏亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准测定上清液蛋白含量。按式（1）计算蛋白提取率：

蛋白提取率（%）=[上清蛋白液蛋白浓度（g/mL）×体积（mL）][苦荞皮粉重量（g）×苦荞皮粉中蛋白质量含量（%）]×100% （1）

1.3.3 苦荞麸皮粉蛋白分离提取工艺单因素试验 根据文献[22]，略作修改。将苦荞麸皮粉于石油醚（1∶5，m/v）中搅拌1 h后，抽滤，收集脱脂皮粉。重复2次后，于通风橱内过夜挥干溶剂。过60目筛，即为脱脂苦荞皮粉，置于4 ℃冰箱冷藏备用。以蛋白提取率为指标，分别考察不同pH、时间、料液比及温度对苦荞麸皮蛋白质提取率的影响，确定最佳的单因素条件范围，每个样本重复3次。

（1）不同pH对苦荞麸皮粉蛋白提取率的影响：精确称取4 g脱脂麸皮粉加入40 mL 的去离子水，用2 mol/L氢氧化钠溶液将pH分别调至7、8、9、10、11、12。pH 稳定后，室温搅拌2 h后离心（6 000 r/min，5 min），收集上清液并定容，采用考马斯亮蓝法测定上清液蛋白浓度。（2）不同提取时间对苦荞麸皮粉蛋白提取率的影响：精确称取4 g脱脂麸皮粉加入40 mL 的去离子水，将pH调至10，分别搅拌0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h 后离心（6 000 r/min，5 min），收集上清液并定容，测定上清液蛋白浓度。（3）不同料液比对苦荞麸皮粉蛋白提取率的影响：精确称取4 g脱脂麸皮粉，分别按料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40加入去离子水，将pH调至10，搅拌2 h后离心（6 000 r/min，5 min），收集上清液并定容，测定上清液蛋白浓度。（4）不同提取温度对苦荞麸皮粉蛋白提取率的影响：精确称取4 g脱脂麸皮粉加入40 mL去离子水，分别放入 25 ℃、35 ℃、45 ℃ 的水浴磁力搅拌锅中，pH调至10，搅拌2 h后离心（6 000 r/min，5 min），收集上清液并定容，测定上清液蛋白浓度。

1.3.4 响应面分析法优化苦荞麸皮粉蛋白质提取条件及验证 （1）响应面分析法优化苦荞麸皮粉蛋白质提取条件：综合pH、提取时间、料液比、提取温度等对苦荞麸皮蛋白提取效果影响的单因素试验结果，确定对苦荞麸皮蛋白提取率影响比较显著的因素为料液比、pH、提取时间，采用响应面法 （Box-Behnken 中心组合）进行三因素三水平的响应面分析，以蛋白质提取率为响应值（表1）。（2）响应面分析法验证：采用数学模型

优化蛋白提取条件，取整进行5次重复试验，计算苦荞麸皮蛋白提取率，验证响应面优化结果。

1.4 数据分析

响应面软件采用Design Expert 12.0，试验数据用均数±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 苦荞全粉与麸皮粉中蛋白含量及Osborne类型蛋白组成的比较

经凯氏定氮法测定，苦荞全粉中蛋白含量为9.07%。苦荞麸皮粉中蛋白含量达到32.4%，约为全粉蛋白含量的3.6倍，因此苦荞蛋白主要富集在麸皮粉中。如图1所示，苦荞全粉、麸皮粉中均是清蛋白含量最高，谷蛋白次之，醇蛋白含量最低，可见清蛋白和谷蛋白是构成苦荞蛋白组成的主要部分。苦荞全粉中的蛋白比例分布与文献报告相似[14，23-24]。与苦荞全粉相比，苦荞麸皮粉中Osborne类型的组成略有不同，谷蛋白所占比例增加，清蛋白及醇溶蛋白所占比例下降。

2.2 苦荞麸皮蛋白提取条件的研究

2.2.1 pH 对蛋白提取率的影响 如图2所示，随着pH值7增加到9，蛋白提取率显著增加。苦荞麸皮粉中谷蛋白含量较高（占31.76%），因此需要采用一定的碱性条件，这样才更有利于谷蛋白的提取。碱性环境能够改变蛋白质结构，使结构更加疏松[25-27]，从而提高蛋白质提取率。pH值达到9后，提取率保持稳定。因此，以pH 9为最佳提取蛋白pH。

2.2.2 料液比对蛋白提取率的影响 如图3所示，随着料液比从1∶10增加到1∶40，蛋白提取率增加，苦荞麩皮蛋白提取率提高了15.8%，达到99.4%。增加料液比有助于增加水分子和蛋白质之间的相互接触，促进蛋白质提取。随后增加提取液体积至1∶50，对于蛋白质溶解无显著提高作用。因此以料液比1∶40为最佳蛋白提取料液比。

2.2.3 提取时间对蛋白提取率的影响 如图4所示，随着提取时间的延长，苦荞麸皮蛋白提取率逐渐提高，提取时间从0.5 h增加到3 h，蛋白质提取率显著提高，从69.39%提高到90.22%，随后，随着提取时间的延长对提取率增加无显著影响。综合考虑，提取时间3 h为最佳提取时间。

2.2.4 温度对蛋白提取率的影响 如图5所示，提取温度对苦荞麸皮蛋白提取率影响不显著，且根据文献报道，苦荞醇溶蛋白的变性温度为53.4 ℃，且温度越高，产生的美拉德反应对蛋白提取效果有一定影响[17]，因此在提取过程中，不宜采用较高的温度，后续试验均采用室温25 ℃为提取温度。

2.2.5 响应面法分析优化苦荞麸皮蛋白提取条件 综合单因素试验结果，根据Box-Behnken中心组合试验原理，设计3因素3水平响应面分析，以蛋白质提取率为响应值，确定最佳提取条件，方案与结果见表2。通过响应值与各因素进行回归拟合后，得到二项多次回归方程：Y=0.94+0.04X1-0.05 X2+0.02X3-0.01X1X2-0.01X1X3+0.01X2X3-0.05X12-0.04X22+0.01X32

由表3可知，模型失拟项F=19.38，P=0.000 4，表明响应面回归模型达到极显著水平。方程失拟项P>0.05，表示失拟不显著;模型确定系数为0.961 4，说明该模型能解释96.14%响应值的变化，因而该模型拟合程度较好，用此模型可以对苦荞麸皮蛋白提取条件进行分析和预测[22，28-29]。由回归模型和方差分析可知道，方程一次项X1、X2，二次项X21、X22对苦荞麸皮蛋白提取率的影响极显著（P<0.01）。方程一次项X3，二次项X23对苦荞麸皮蛋白提取率的影响显著（P<0.05）。根据F值可知，各个因素对蛋白提取率的影响大小顺序为料液比（X2）> pH（X1）>时间（X3）。

等高线直观反映各个因素对蛋白提取率交互作用的程度。等高线呈圆形则表明两因素相互作用不显著，而呈现椭圆形或者马鞍形则表示两因素交互作用显著。由图6等高线偏圆形可知，pH与料液比之间的交互作用不显著。通过响应面分析并优化，pH 10.32、料液比1∶36.37、时间3.68 h为最优化提取条件，预测蛋白提取率为97.1%。随后，采用数学模型优化蛋白提取条件，从而验证响应面法优化结果，且取整数。取pH 10.5、提取料液比1∶35、提取时间3 h 40 min，进行5次重复试验，蛋白提取率为（97.31±4.64）%。因此，采用响应面分析法优化得到的苦荞麸皮蛋白提取条件准确可靠。

3 结论与讨论

苦荞蛋白大多集中苦荞麸皮粉中，因此其蛋白具有较高的利用价值。本试验探究碱法对苦荞麸皮粉蛋白提取率的影响。通过提取pH、料液比（w/v）、时间、温度等4个因素对麸皮蛋白提取率的影响，筛选影响显著的因素进行响应面优化试验。根据Box-Benhnken 试验设计，建立pH、料液比、时间对苦荞麸皮粉提取率的回归模型，通过试验验证了该方法的可靠性，能较好地预测苦荞麸皮蛋白提取率。本试验得到优化提取工艺为pH 10.5、提取料液比1∶35、提取时间3 h 40 min，在最佳工艺下，蛋白提取率为（97.31±4.64）%。与预测结果相符，该优化条件准确可靠，为后续苦荞麸皮蛋白提取工艺、蛋白结构及性质的研究提供科学依据。

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Optimization of Protein Extraction Process from Tartary Buckwheat Bran by Response Surface Methodology

WU Lan-lan 1，WU Wei-jing1，2，3，WANG Li-bo4，LI Jian-hua1

（1Xiamen Medical College，Xiamen 361023，China;2Engineering Research Center of Natural Cosmeceuticals College of Fujian Province，Xiamen 361023，China;3Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering，Xiamen 361018，China;

4College of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China）

Abstract：ObjectiveTo analyze the protein content and composition of tartary buckwheat bran.Method The protein was extracted by alkali combined with isoelectric precipitation. On the basis of single-factor tests，three influencing factors including solid-liquid ratio（w/v），pH and time were selected. Box-Behnken response surface method was used to optimize the protein extraction process from tartary buckwheat bran.Result Solid-liquid ratio （w/v），pH and time had significant effects on the protein extraction rate from tartary buckwheat bran，and the order of influence was solid-liquid ratio （w/v）> pH > time. The optimal extraction conditions were pH 10.5，solid-liquid ratio 1：35 and extraction time 3 h 40 min.Under these conditions，the protein extraction from tartary buckwheat bran were （97.31±4.64）%.Conclusion  The study can provide scientific basis for the effective development and utilization of tartary buckwheat bran protein.

Keywords：tartary buckwheat bran;protein extraction;pH;solid-liquid ratio;time;Response Surface Method

基金項目：福建省中青年教师教育科研项目（项目编号：JT180655）;国家级大学生创新创业训练项目 （项目编号：202012631002）;厦门医学院自然科学类项目（项目编号：KPT2020-04）;天然化妆品福建省高校工程研究中心（厦门医学院）开放课题（项目编号：XMMC-NC202101）。

作者简介：吴兰兰（1985— ），女，硕士，讲师，研究方向：天然产物结构及活性。

通信作者：吴伟菁 （1989— ），女，博士，试验师，研究方向：功能食品。