心肌肌钙蛋白I（cTnI）荧光免疫层析试剂研究

程涛

（安邦（厦门）生物科技有限公司，福建厦门 361028）

对于急性心肌梗死患者，发病90 min内为其最佳的时间窗，由于常规的心肌标志物检测需采集血液后送往实验室进行检测，此过程往往耗时较长，不利于患者诊断及预后[1]。荧光层析免疫试剂配合便携式分析仪器可以进行床旁采样、现场检测，此试剂程序简单、检测速度快，对于急诊科急性胸痛患者的诊断具有重要临床意义[2]。本研究研制了心肌肌钙蛋白 I（cTnⅠ）的荧光免疫层析试剂并进行了性能评价，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鼠抗cTnI单克隆抗体（clon1），珠海博美生物科技有限公司；羊抗cTnI多克隆抗体（clon2），菲鹏生物股份有限公司；荧光微球，200 nm，长沙美牛生物科技有限公司；硝酸纤维素膜，规格2.5 cm×100 m，默克化工技术（上海）有限公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC），纯度≥99%，酪蛋白钠盐（casein.Na），纯度≥95%，购自Sigma公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；塑料卡，规格2 cm×10 cm，厦门欣海盛塑胶有限公司；玻璃纤维，杭州韩感科技有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-250DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；QB-128型旋转混匀仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TGL-20M型高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HM3230型三维平面点膜喷金仪，上海金标生物科技有限公司；ZQ4200型数控感应斩切机，上海金标生物科技有限公司；AF-100型荧光免疫分析仪，安邦（厦门）生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 包被板制备

把硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴在PVC板上。用磷酸盐缓冲液（pH=7.0）将羊抗cTnI多克隆抗体及羊抗兔IgG多抗稀释至1 mg/mL，以1 μL/cm的包被量包被于硝酸纤维素膜上，在湿度≤30%条件下干燥16～24 h，制备得cTnI包被板备用。

1.3.2 标记物制备

将1 mL荧光微球原液加入到9 mL PBS溶液中，超声30 s后以18 000 r/min的转速离心30 min，小心去除上清。加入10 mL PBS溶液，超声60 s，混匀。取0.4 mL的0.6 mg/mL EDC溶液加入到洗涤后的荧光微球溶液中，用旋转混匀仪混匀1 h，离心（18 000 r/min、30 min），小心去除上清。加入10 mL PBS溶液超声30 s混匀。以0.5 mg/mL蛋白浓度加入鼠抗cTnI单克隆抗体，在旋转混匀仪上混匀2 h。加入1 mL10%的BSA溶液进行封闭，旋转混匀仪上混匀14～18 h。18 000 r/min、离心30 min，小心去除上清，加入10 mL PBS溶液，超声60 s，标记完成，制得cTnI的标记物2～8 ℃条件下保存。以相同方法制备兔IgG荧光微球标记物。

1.3.3 标记物结合垫制备

用标记物稀释液稀释cTnI标记物和兔IgG标记物，终浓度为0.1 mg/mL，制得标记物喷涂溶液。使用喷金仪以1 μL/cm的喷量把标记物喷涂溶液固定在标记垫上。喷涂后，标记垫放置在湿度≤30%环境下晾干16～24 h。

1.3.4 样品垫制备

配制样品垫处理液，10 mmol/L PBS溶液（pH=7.4）中包含0.3 mg/mL的抗RBC和1%的casein.Na，取40 mL样品垫处理液加在玻璃纤维上，铺匀液体后在湿度≤30%环境下干燥16～24 h。

1.3.5 检测卡制备

在包被板上依次放置标记物结合垫和样品垫。组装好的检测板用数控感应斩切机切成4 mm宽的检测条，将检测条放在PVC塑料卡里面压紧，与干燥剂一起放在铝箔袋中封装保存。

1.3.6 试剂的定标

把国家标准物质和cTnI抗原分别用含有1%BSA的10 mmol/L PBS缓冲液（pH=7.0）稀释制成0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、20.0 ng/mL和50.0 ng/mL 6个浓度点，用检测卡进行检测。信号值和浓度值使用四参数方程进行拟合，得到的标准曲线写入IC卡中。

1.3.7 试剂检测方法

血清的加样量为100 μL，全血的加样量为120 μL。反应15 min后进行读数。数据采用SPSS软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 准确性

用cTnI国家标准品制备的参考品，浓度分别为0.3 ng/mL、10 ng/mL，每个浓度参考品均作为样本各检测3孔，检测3次，检测0.3 ng/mL参考品平均值0.295 ng/mL，相对偏差-1.67%；检测10 ng/mL参考品平均值10.38 ng/mL，相对偏差3.8%。

2.2 分析灵敏度

2.2.1 空白限（LoB）的建立

用空白样本（pH=7.0、10 mmol/L PBS溶液+1%BSA）进行检测，每天测试2次，每次重复测定2次，共测定20次。检测结果属于正态分布，平均值为0.017，标准偏差SD=0.004，空白限LoB=0.024。

2.2.2 检出限（LoD）的建立

选取5个低浓度样本，用试剂对各样本进行重复检测，每天检测5次，连续检测3 d，最终得到75个低浓度的结果，如表1所示。

表1 低值样本测定结果（n=15）

根据检测结果进行统计分析：低浓度样本检测结果进行正态性检测，P=0.002＜0.05，结果不呈正态分布，按非参数方法估计LoD。取0.07 ng/mL作为试剂的检出限。

2.3 精密性

取心肌肌钙蛋白I（cTnI）测定试剂盒（荧光免疫层析法），分别用浓度为0.3 ng/mL、10.0 ng/mL的参考品进行检测，每天检测1次，每次每个浓度平行检测2次，连续检测20 d，进行精密度分析；2个浓度参考品检测结果的变异系数分别是7.54%和9.00%。

2.4 特异性

心肌肌钙蛋白T（cTnT）、心肌肌钙蛋白C（cTnC）、骨骼肌型肌钙蛋白I（sTnI）分别用参考品稀释液进行稀释，制备成浓度为1 000 ng/mL的特异性样本；用试剂分别检测上述制备样本，每个样本平行检测3次。检测结果表明，在1 000 ng/mL浓度条件下，cTnI检测结果均＜0.07 ng/mL，未出现非特异反应现象。

2.5 干扰试验

按照1 mL高、中、低浓度样本+0.1 mL PBS溶液（10 mmol/L、pH=7.0，含1% BSA）的方式制得对照样本，按照1 mL样本+0.1 mL干扰物溶液（3 850 μmol/L胆红素、440 mmol/L甘油三酯、22 g/L血红蛋白和16 500 IU/mL类风湿因子）的方式制得干扰样本。用检测试剂分别检测对照样本和干扰样本，计算与对照样本的相对偏差，结果见表2。由表2可知，干扰物在实验浓度条件下不影响样本检测结果。

表2 干扰实验样本检测结果

2.6 线性范围

将cTnI抗原用参考品稀释液进行稀释，配制成系列浓度点。检测系列浓度点样本，每个样本测试3次，建立标准曲线方程。用该曲线方程计算浓度样本的测定值，以理论浓度（x）为自变量，以检测结果均值（y）为因变量进行线性回归，绘制出剂量反应曲线，确定线性范围。如图1所示，试剂线性方程y=1.001 7x-0.003 6，相关系数R2=0.999 9。因此，心肌肌钙蛋白I（cTnI）测定试剂盒（荧光免疫层析法）的线性范围为0.1～50.0 ng/mL。

图1 浓度线性图

2.7 血清、血浆和全血检测对比

准备好6种不同颜色的真空采血管，用于采集血样制备血清、抗凝血浆样本，以红色采样管的血清样本结果为基准，比较其他血清、血浆样本对检测结果的影响，见表3。准备5组样本，红细胞压积分别为20%～30%、30%～40%、40%～50%、50%～60%及60%～70%。以血浆样本结果为基准，比较不同红细胞压积全血样本对检测结果的影响，见表4。结果显示，红细胞压积在30%～50%范围内对检测结果与血浆相比无显著性差异。常规的促凝剂采血管（橘红色）、惰性分离胶采血管（黄色）、肝素钠抗凝剂采血管（绿色）、EDTA-K2抗凝剂采血管（紫色）及枸橼酸钠抗凝剂采血管（蓝色）检测结果与血清管（红色）一致，不同采血管均不影响试剂的检测结果。

表3 血清与血浆样本检测结果

表4 不同红细胞压积率全血样本统计分析结果

2.8 临床性能验证

采用与已批准上市、临床普遍认为质量较好的产品进行同步盲法对比试验研究，考察考核试剂的临床应用性能与该已上市产品的等效性。104例样本的检测结果见表5。

表5 104例样本检测结果的符合率

Bland-Altman一致性评价[3]：所有的点均在95%一致性界限以内；在一致性界限范围内，比值均在0.8～1.2，认为两种方法具有较好的一致性。

2.9 分段回归分析

分段回归分析结果如图2、图3。其中图2为对比试剂检测值＜2的回归分析，图3为对比试剂检测值≥2的回归分析。

图2 考核试剂与对比试剂测试结果线性图（R2=0.971 6）

图3 考核试剂与对比试剂测试结果线性图（R2=0.978 8）

104例血清样本中，1例样本对比试剂检测结果为阳性，考核试剂检测结果为阴性；1例样本对比试剂检测结果为阴性，考核试剂检测结果为阳性；该2例样本两种试剂检测结果均在参考值附近，认为该样本属于临界值样本。本心肌肌钙蛋白I（cTnI）测定试剂盒（荧光免疫层析法）与已批准上市、临床普遍认为质量较好的产品的检测结果无统计学差异，并且具有高度一致性。

3 结论

近年来，我国急性心肌梗死的发病率越来越高，且发病逐渐年轻化。WHO推荐指南将心电图、cTnI等心肌酶谱检测视为临床诊断急性心肌梗死的金标准。在临床中，缩短急性心肌梗死的诊断时间对于患者预后具有重要的临床意义。对研制的cTnI荧光免疫层析试剂进行评价，结果表明该试剂准确度高，灵敏度好，抗干扰能力强，临床检测符合性好，作为化学发光试剂和其他同类型试剂的有益补充，可以在急诊科急性胸痛患者的诊断中发挥出重要的临床价值。