同位素内标稀释液质法测定婴幼儿配方乳粉中维生素K1

公丕学，廉贞霞，王艳玲，薛霞，戴琨，刘桂亮，王骏，刘艳明，赵发

（1.山东省食品药品检验研究院，山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心，山东省食品药品安全检测工程技术研究中心，济南 250100；2.山东省药学科学院，济南 250100；3.方正县产品质量综合检验检测中心，黑龙江 方正 150800）

0 引 言

维生素K1是一种脂溶性维生素，缺乏时会引起失血[1]，在临床上被广泛用于防治获得性维生素K依赖性凝血因子缺乏症[2]和新生儿自然出血症[3-4]。生产婴幼儿配方乳粉时需要适量添加。

检测维生素K1的方法有毛细管电泳法[5-6]，分光光度法[7-8]，液相色谱-紫外法[9-12]，液相色谱-柱后衍生荧光法[13-15]。毛细管电泳法、分光光度法灵敏度低，准确度差；液相色谱-紫外法干扰严重，定量不准确；液相色谱荧光法流动相中使用二氯甲烷，对仪器损害大。液质法检测速度快，灵敏度高，定性定量准确。

本文采用同位素稀释内标UPLC-MS/MS法对婴幼儿配方乳粉中维生素K1含量测定进行研究，通过加入内标提高了定量准确性，并对样品前处理、色谱质谱条件进行优化，提高了检测灵敏度、准确度。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

TSQ Quantiva超高效液相色谱串联质谱联用仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；配备HESI电离源、BSA822-cw型电子天平，德国Sartorios公司；AB204-S型电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；MS3旋涡混合器，德国IKA公司；SB-800DTD型超声波清洗器，中国宁波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷冻离心机，德国Sigma公司；M illi-Q超纯水仪器，美国M illipore公司；45位恒温氮吹仪，美国Organomation公司；SW 22恒温水浴振荡器，德国优博莱公司。

维生素K1标准物质，德国Dr.Ehrenstorfer公司；脂肪酶（活力≥700 U/mg），德国sigma公司；甲醇（色谱纯）,美国Fisher公司；正己烷（色谱纯）,美国Merck公司；无水乙醇、氯化钠（分析纯）,国药集团化学试剂有限公司；醋酸铵（色谱纯），德国Flukar公司；色谱柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm），美国Waters公司；0.22 μm有机微孔滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 标准溶液

1.2.1 维生素K1标准溶液校正

准确称取维生素K1固体标准物质20.0 mg至烧杯中，用正己烷溶解，转移至10 mL容量，并用正己烷定容至刻度。取200μL至25 mL容量瓶中，用正己烷定容，配置待校正维生素K1标准溶液，在248 nm下用紫外分光光度计进行校正（具体校正方法见国标[16]）。

1.2.2 标准工作曲线配制

准确称取1 mg（精确至0.01 mg）维生素K1-D7同位素内标，用甲醇溶解转移至10 mL容量瓶中用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为100 mg/L内标溶液。准确移取维生素K1校正储备液，用甲醇配制系列标准工作液质量浓度分别为5，10，20，50，100，200，500μg/L；其中每个标准点含维生素K1-D7同位素内标质量浓度为50μg/L。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件

BEH C18色谱柱:100 mm×2.1 mm，1.7μm；流动相:A甲醇，B乙酸铵（含体积分数0.1%甲酸）；梯度洗脱程序：0～4.0 min，A由10%线性变化至90%，保持2.0 min，6.1 min时，A由90%变为10%，并保持1.9 min。流速为0.3 mL/min；柱温为35℃；进样量为5μL。

1.3.2 质谱条件

离子化模式为ESI+；鞘气流速为13.3 L/min；辅助气流速为4.0 L/min；电喷雾电压为3 500 V；离子导管温度为333℃；气化温度为317℃；碰撞气压力为0.266 Pa。维生素K1及同位素内标的离子对及锥孔电压、碰撞电压、驻留时间如表1所示。

表1 质谱参数优化

1.3.3 基质效应评价

在液相色谱串联质谱定量检测中，基质成分改变喷雾液滴张力和黏度，导致离子化程度不同，对目标物电离效率会产生影响，从而会使定量结果不准确，需要考察质谱方法的基质效应，以便选择合适的定量方式。在经过处理后的样品溶液中加入维生素K1内标，通过与维生素K1内标标准溶液进行比较，可以通过计算，定量评价目标物的基质效应。为考察维生素K1的基质效应，可以通过比较同位素内标在标准溶液和样品处理液中响应值获得。通过基质效应计算，即

式中：A为标准溶液中维生素K1内标的峰面积；B为样品处理液中维生素K1内标的峰面积。在样品处理液中加入与标准溶液相同浓度的维生素K1内标。如果通过计算基质效应约等于0%，说明没有基质效应；如果基质效应大于0%，说明出现了离子抑制效应，即基质抑制；如果基质效应小于0%，说明出现了离子增强效应，即基质增强。

1.4 样品处理程序

1.4.1 酶解样品

称取2.50 g乳粉样品置于50 mL离心管中，加250μL维生素K1内标（质量浓度为1 mg/L），加入10 mL温水分散溶解样品，加入0.6 g脂肪酶，涡旋混匀后，在振荡器中（37±1）℃下恒温连续振荡6 h，待试样酶解完全。

1.4.2 提取目标物

取出试样放置至室温后，加入10 mL乙醇，涡旋混匀，加1 g碳酸钾，充分混合均匀后，再加10 mL正己烷振荡5 min，转速为8 000 r/min高速离心后，取上层溶液至另一离心管中，再用10 mL正己烷重复振荡提取一次，合并两次上层提取液。向其中加入10 mL饱和氯化钠溶液，涡旋5 min，充分混匀，静置分层后，取全部上层溶液至离心管中，氮吹，用移液枪准确加1 m L甲醇，涡旋超声，复溶后，过有机滤膜，滤液待上机测定。

2 结果与讨论

2.1 实验条件考察

2.1.1 酶解条件的优化

维生素K1属于脂溶性维生素，而乳粉中含有大量脂肪，因此维生素K1与乳粉中脂溶性物质形成结合态，很难被直接提取。通过使用脂肪酶酶解样品中脂肪使其降解生产不饱和脂肪酸，维生素K1成为游离态，容易从样品溶液中提取。考察了不同脂肪酶用量以及酶解时间对样品的提取效率。脂肪酶用量根据样品中脂肪含量不同而有所不同，脂肪酶用量结果如图1所示，经过多次实验，脂肪酶使用量为0.6 g时，提取效率能达到90%以上，满足实验要求，低于0.6 g时，提取效率低于80%，说明样品中脂肪不能被脂肪酶酶解完全，仍然存在结合态，导致提取充分，提取效率低。

图1 脂肪酶用量对提取效率的影响

脂肪酶在降解样品中脂肪时，需要足够的反应时间，酶解时间结果如图2所示。当酶解时间达到6 h时，提取效率能够达到90%以上；低于6 h时，提取效率不足80%，可能是因为脂肪酶与脂肪在发生反应时，至少需要6 h以上才能反应完全。因此最终选择0.6 g脂肪酶，酶解6 h作为最佳酶解条件。

图2 酶解时间的优化

2.1.2 皂化条件的优化

皂化是通过用碱使酶解后的脂肪生成能溶于水相的脂肪酸盐，因此碱的加入量会影响目标物的提取效率。碱量不足则会导致皂化反应不完全，萃取时乳化严重，分层不明显，部分脂溶性维生素K1可能分散在乳化层中，导致提取效率降低；碱量过多则会和维生素K1反应，提取效率降低，同时导致测定结果偏低。实验考察了NaOH溶液和固体K2CO3两种碱对提取效率的影响，结果显示当使用NaOH溶液（浓度为10 mol/L，2 mL）时提取效率低于70%，推测可能是碱过量导致与样品溶液中维生素K1发生反应；K2CO3（1 g）提取效率能达到90%，说明碱量适合，因此皂化时选择加入1 g的K2CO3。

2.1.3 基质效应评价结果分析

婴幼儿配方乳粉中含有添加的维生素K1，因此使用基质加标或外标的方式评价不同样品的基质效应会存在较大差异，评价结果准确性差，样品中不含有维生素K1的同位素内标，使用同位素内标进行基质效应评价更能反应方法的准确性和可靠性。在样品处理液中加入与标准溶液相同浓度的同位素内标标准物质。如果基质效应约等于0%，说明几乎不存在基质效应；如果基质效应大于0%，说明样品中产生了离子抑制效应，即基质抑制；如果基质效应小于0%，说明样品中产生了离子增强效应，即基质增强。

通过1.3.3基质效应计算同位素内标在婴幼儿配方乳粉中的基质效应，质量浓度为50μg/L维生素K1内标基质效应在52%～74%，则说明样品对维生素K1内标有较强抑制作用，标准溶液定量样品含量偏差较大，该定量方式不适合选择标准溶液外标法。因此选择定量方式为同位素内标法定量，更准确，该方法能够对乳粉中维生素K1准确定量。

2.1.4 色谱条件的优化

色谱使用流动相的酸碱性对目标化合物的离子化效率有影响，也可以改善色谱峰峰形，在本试验中比较了中性流动相甲醇-水和酸性流动相甲醇（含体积分数0.1%甲酸）两种流动相体系。由于实验中维生素K1采用电喷雾电离正离子模式的检测，流动相中含有提供质子的酸能够提高维生素K1离子化效率，增强信号强度。在BEH C18色谱柱上分离试样，流动相甲醇-10 mmol/L乙酸铵（含体积分数0.1%甲酸）目标物峰形较好，质谱信号强度增强，灵敏度提高，因此选取甲醇-10 mmol/L乙酸铵（含体积分数0.1%甲酸）作为流动相。

2.1.5 质谱条件的优化

将质量浓度为100μg/L的维生素K1和维生素K1-D7同位素内标标准溶液通过蠕动泵进入质谱仪，在ESI+模式下对目标物母离子分别进行扫描，确定目标物的准分子离子峰为[M+H]+，维生素K1及维生素K1-D7的母离子m/z分别为451.426和458.457；调节离子源参数后做子离子扫描，同时对子离子进行碰撞能等质谱参数优化，选择离子丰度较高的两对子离子，其中以丰度相对较高的子离子作为定量离子，丰度相对较低的子离子作为定性离子。维生素K1MRM色谱如图3所示；维生素K1-D7内标标准溶液的MRM色谱如图4所示。

图3 维生素K1标准溶液的MRM色谱

图4 维生素K1内标标准溶液的MRM色谱

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围与检出限

将系列标准工作曲线溶液分别进样5μL，以定量离子峰面积与同位素内标定量离子峰面积比值为纵坐标，以维生素K1标准溶液质量浓度（μg/L）为横坐标，绘制标准工作曲线，得出线性回归方程为y=0.02447x+0.00629，线性相关系数0.9998，以信号与噪音比值S/N≥3作为检出限，计算检出限为1 ng/g，以信号与噪音比值S/N≥10作为定量限，计算定量限为2 ng/g。

2.2.2 方法回收率和精密度

采用婴幼儿配方乳粉样品，进行实验。分别添加质量分数为10、50和100 ng/g 3个水平，按照步骤1.4进行处理和测定，具体实验结果见表2所示。

表2 添加回收率与精密度(n=6) ng/g

由表2可见，维生素K1的回收率在88.0%～102.5%。不同水平加标样品样品重复测定6次，测定结果表明RSD为1.75%～5.26%。结果表明，该方法能够满足实际样品的检测需要。

2.2.3 实际样品测定

使用所建立的方法，对市售25批次婴幼儿配方乳粉进行检测，结果均符合明示值。通过购买美国NIST SRM 1849a婴儿/成人营养配方标准品（标注值为1.06±0.17μg/g），按照步骤1.4同时进行6批样品平行处理，测定结果见表3所示，平均值为1.04μg/g，在0.95～1.12μg/g范围内，RSD为6.02%，所建立的方法测定结果符合标准质控样品真值。

表3 营养配方标准品测定结果 μg/g

3 结论

使用脂肪酶对乳粉样品酶解，皂化，正己烷提取，饱和氯化钠水洗，浓缩，内标法定量，能够高效提取样品中维生素K1，能够提高方法的灵敏度及准确度。通过对酶解条件进行优化，碱种类选择，并对色谱条件和质谱参数进行了优化，建立了检测婴幼儿配方乳粉中维生素K1的同位素内标稀释超高效液相色谱串联质谱方法。

本方法具有线性范围宽，检出限低，灵敏度高，定性、定量准确等优势，维生素K1的加标回收率在88.0%～102.5%，重现性好，适用于婴幼儿配方乳粉中维生素K1的定量检测。本方法能够为生产企业和检验机构检验婴幼儿配方乳粉中维生素K1含量提供技术支持。