桑属植物总RNA的提取及花青素合成基因MCHS的鉴定

李姣玉，邢玉薪，姚悦璠，刘开创，康少博，杨 艳

（1.太原科技大学 化学与生物工程学院，山西 太原 030006；2.福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350000；3.哈尔滨医科大学 生命信息学院，黑龙江 哈尔滨 150000）

植物组织中总RNA 的提取是分子生物学研究的基本手段之一，基因获得、cDNA 文库、Northern 印迹、基因转录调控等现代生物技术手段均需以高质量的RNA 为前提。目前的RNA提取方法有Trizol、CTAB法、SDS-酚等，但目前桑科植物总RNA 提取报道相对较少[1-2]。桑果中含有大量的花色素苷类物质，该物质具有防止UV、病原菌对植物产生伤害，调节生长素在植物体内的运输，消除动植物细胞内氧自由基、消炎、抗癌等多种功能[3]。

研究表明，类黄酮等花色素的生物合成途径包含3 个阶段。首先，苯丙氨酸脱氢酶（Phenylalanine dehydrogenase,PAL）催化苯丙氨酸为肉桂酸，经肉桂酸-4-羟基化酶（Cinnamic acid 4 hydroxylase,C4H）、4-香豆酰辅酶A 连接酶（4-Coumarate coenzyme A ligase,4CL）催化，生成香豆酰辅酶A（P-Coumaroyl-CoA）；其次，查尔酮合成酶（Chalcone synthase,CHS）催化香豆酰辅酶A 和丙二酰辅酶A（Malonyl-CoA）生成柚皮素查尔酮，即查尔酮，查尔酮再经查尔酮异构酶（Chalcone isomerase,CHI）催化转化成柚皮素；最后，黄烷酮3-羟化酶（Flavanone 3-hydroxylase,F3H）进一步催化为二氢黄酮醇化合物，在二氢黄酮醇还原酶（Dihydroflavonol 4-reductase,DFR）、花青素合成酶（Anthocyanidin synthase,ANS）催化作用下，分别形成天竺葵素、矢车菊素和翠雀素等物质。报道表明，CHS、CHI 和F3H 是花青素形成所必需，其抑制或过表达均会影响植物最终的花色及抗逆性状态等[3]，见图1。

图1 花青素生物合成途径Fig.1 The biosynthesis pathway of anthocyanins

本研究以桑叶及果实为试验材料，通过改进和优化的Trizol 法提取其RNA 并克隆桑叶MCHS基因或类似MCHS基因本研究以桑叶及果实为试验材料，并改进优化Trizol 法提取RNA 及克隆桑叶MCHS基因，其不仅有助于从分子水平研究桑科类黄酮代谢机制，还为研究MCHS的进化、桑葚花青素提取、合成与鉴定等提供基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料及试验用品处理

样品：新鲜桑叶及其果实。5 月底—7 月初，采集于太原科技大学南校区，-80℃冰箱保存备用，用于总RNA提取。

试验所用试剂均由灭菌的0.1%DEPC水配制；研钵、玻璃器皿等由0.1%DEPC 水处理24 h后，进行20～30 min的高压灭菌；氯仿、苯酚等药品均为分析纯；Trizol 试剂为上海生物工程有限公司产品；逆转录试剂盒PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）购自宝生生物有限公司。

本试验所用PCR引物根据收录于NCBI上的桑科CHE设计，NCBI 登录号：KT630885，具体序列见表1，引物序列由北京华大基因有限公司合成。

表1 扩增MCHS基因引物序列Tab.1 Primer of MCHS gene

1.2 试验方法

1.2.1 Trizol法提取总RNA

取0.1 g新鲜样品放入液氮预冷的研钵中，边加液氮边研磨，直至细粉状为止；预先在离心管中加入1 mL Trizol 溶液，迅速将研磨好的细粉加入离心管中；立即用振荡器振荡2 min，随后在室温下振荡10 min，静止数秒后，放入冰箱冷藏，使温度降为4℃，离心5 min，转速为12 000 rpm；预先在新离心管中加入200 μL 氯仿，将上清液迅速转移至离心管，立即振荡2 min，随后在室温下振荡5 min，静置2 min后，放入冰箱冷藏，使温度降为4 ℃，然后离心10 min，转速为12 000 rpm；于新离心管中加入200 μL 氯仿，将上清液迅速转移至离心管，快速振荡15 s，放入冰箱冷藏，使温度降为4℃，然后离心10 min，转速为12 000 rpm；预先在新的离心管中加入500 μL异丙醇，将上清液迅速转移至离心管，缓慢颠倒离心管；-80℃下沉淀1h；从冰柜中取出含有RNA 沉淀的离心管，在4℃的条件下离心10 min，转速为12 000 rpm，小心弃上清；随后加入1 mL 75%乙醇，振荡器振荡，在4℃下离心5 min，转速为12 000 rpm，小心弃上清，短暂离心后用移液枪吸去剩余上清，超净台自然干燥2 min，加入16 μL DEPC 处理后重新溶解。

1.2.2 RT-PCR扩增MCHS基因

使用Takara 公司的PrimeScript ™RT reagent Kit with g DNA Eraser 试剂盒，将所提取的桑叶总RNA 反转录为cDNA并以该cDNA 为模板进行PCR 检测，PCR 引物为反应体系为（20 μL）为：10×PCR buffer 4.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上游引物（10 μmol/L）2.0 μL，下游引物（10 μmol/L）2.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.5 μL，反转录产物2 μL，ddH2O 9 μL。反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，30 个循环；72℃延伸10 min，4℃保存备用。取5 μL 扩增产物，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察记录结果。

1.3 总RNA的完整性及质量检测

1.3.1 电泳检测

DEPC 水稀释TAE 后，取2 μL 的RNA 样品与1 μL 溴酚蓝混合后进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，电泳时间为30 min，电压为100 V，在紫外凝胶成像系统上对RNA 条带的清晰度和完整性进行观察，并拍照记录。

1.3.2 RNA质量检测

参照奥斯伯等的方法，取10 μL总RNA溶液，加DEPC 水稀释至1 mL，分别在230 nm、260 nm 和280 nm 处测量吸光值。并计算A260/A280、A260/A230的比值。

RNA产量（μg）=RNA浓度（μg/mL）×VDEPC－H2O（mL）

2 结果与讨论

2.1 Trizol法提取的桑叶及果实中总RNA的质量分析

见图2，使用Trizol 法从桑叶及桑葚中均可以提取出总RNA，但通过电泳分析发现，在条带完整性和强度上，从叶和果中获得的RNA 存在差别。果实中因糖、酚含量较高，28 s和18 s 条带较模糊，且无5.8 s，同时放置一周后，样品组织中RNA大部分降解。

图2 桑叶与桑果总RNA电泳检测Fig.2 Electrophoresis for total RNA of mulberry leaves and mulberry

桑叶中提取的RNA 条带完整，带型较好，未发生明显的降解，28 s 的亮度是18 s 的2 倍左右，并且5.8 s 亮度较弱，说明该样品的完整性良好。

2.2 Trizol法提取的总RNA纯度和得率

从表2 可以看出，提取自桑叶中的RNA，其OD260 nm/OD280 nm 的值在1.8～2.0，可说明未受蛋白质或酚类污染；而提取自桑果中的RNA，其OD260 nm/OD280 nm 的值＜1.8，说明受蛋白质及其他有机物污染较明显。在后续的RTPCR 试验中，使用无污染的桑叶RNA 进行反转录及MCHS基因扩增。

表2 Trizol法提取的RNA的纯度及得率Tab.2 Isolated RNA purity and yield by Trizol methods

2.3 桑叶MCHS基因的鉴定

以提取的桑叶总RNA 为模板进行RT-PCR 检测，引物是根据NCBI上已收录的桑科CHE设计2对简并引物MCHS（1-393）、MCHS（36-393），其中MCHS（1-393）扩增为查尔酮酶基因的全长序列，MCHS（36-393）扩增的为查尔酮酶的关键区域，RT-PCR 结果，见图3。从桑叶RNA 中获得的查尔酮合成酶基因全长序列为1 200 bp 左右，关键区域序列为1 000 bp左右，序列大小与大多数物种CHS相似。

图3 桑叶提取MCHS基因扩增结果Fig.3 MCHS by RT-PCR isolated from mulberry leaves

3 结论

山西桑属资源丰富，研究报道表明，桑属资源含有丰富的活性蛋白、维生素、氨基酸、胡萝卜素、矿物质等；同时桑果还具有补肝益肾、补血养颜等功效。以桑叶作为研究对象，对其细胞水平进行深入研究，其结果对于山西省桑葚的种植、开发与推广具有重要实践性意义。

在桑属植物的类黄酮生物合成过程中，MCHS是第一关键酶，对其抑制或过表达将直接影响苯丙氨酸和丙二酰-CoA的结合，从而影响花色素合成、抗病性以及抗UV 性等。有研究表明，利用RNA 干扰技术使花素夏堇中的CHS 基因沉默，或矮牵牛CHS基因突变，均可获得花色花粉不同的新品种[6]。

本研究以桑葚为试验材料，通过改进和优化的Trizol 法提取其RNA 并克隆桑叶MCHS基因，Trizol 法提取桑科RNA操作简单，结合氯仿、苯酚等提取试剂，提取时间为2～3 h。该方法具有可重复性强、提取RNA 完整性好等优点，所提取RNA 可直接进行后续的RT-PCR 反转录试验，不需要DNase消化，因此是植物RNA 的理想提取方法之一，该结果为分子水平上揭示花青素的形成机理奠定基础。