ddPCR与ARMS-PCR检测NSCLC患者EGFR基因T790M突变的比较研究*

李月，徐玉霞

510060广州，中山大学肿瘤防治中心 华南肿瘤学国家重点实验室，肿瘤医学协同创新中心

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占80%～85%[1-2]。近年来的研究发现，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)对携带EGFR敏感突变的NSCLC患者具有显著疗效[3]。然而，患者通常在接受一/二代TKI靶向治疗后10～16个月时会不可避免地发生获得性耐药[4]。EGFR基因第20号外显子发生的T790M错义突变约占所有获得性耐药机制的50%～60%[5-7]。第三代TKI奥希替尼可针对T790M错义突变，为患者带来约38个月的无进展生存[8]，对原发T790M突变患者也具有治疗效果[9-10]。因此，在EGFR-TKI治疗开始前和治疗过程中，对NSCLC患者进行EGFR基因T790M突变检测和动态监测,对于及时发现耐药和调整治疗方案十分重要。

突变扩增阻滞系统PCR(amplification refractory mutation system PCR,ARMS-PCR)利用引物的3’端碱基与模板碱基若不互补则无法延伸的原理，使引物3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来，此方法已广泛用于包括EGFR在内多种基因的热点突变检测，灵敏度可达1.0%，方便快捷，应用广泛。微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)又称第三代PCR，基本原理是将一个样本分到几百到几万个不同的反应单元，每个微滴单元包含一个或多个拷贝的DNA模板，所有单元同时对目标分子进行扩增，然后根据泊松分布原理统计和定量，是一种无需引入标准曲线、无需受扩增效率影响的绝对定量技术，不仅兼具ARMS-PCR操作便捷、实验周期短的优点，而且具有更高的敏感性，检测下限可低至0.1%，样本用量少，尤其适合检测外周血循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)样本。

此外，目前分子诊断领域检测EGFR基因T790M突变的方法还有Sanger测序、二代测序法(next-generation sequencing,NGS)等[11-12]。Sanger测序是最早应用于EGFR基因突变检测的技术之一，此方法虽然成本低，特异性高，但对标本的质量要求较高，实验操作过程繁琐、耗时长，且敏感性低。因需提前针对目标序列设计引物，Sanger测序与ARMS-PCR、ddPCR一样都只能检测已知位点的突变。近年来迅速崛起的NGS技术可一次对几十万到几百万条DNA分子进行测序，检测通量高、变异类型覆盖全面，不仅可以检测到未知突变，还可以评估患者的肿瘤突变负荷和微卫星不稳定状态。但因NGS实验流程复杂、检测成本高、报告周期长等因素，一般不被临床作为单基因热点突变检测的首选方法。本研究回顾性收集NSCLC患者组织、胸水脱落细胞、外周血cfDNA样本，同时采用ARMS-PCR和ddPCR方法检测T790M突变，以对比两种方法的检测效能和适宜样本类型，以期为临床及病理医生在选择检测技术方面提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 样本

回顾性收集中山大学肿瘤防治中心分子诊断科行ddPCR检测EGFR基因T790M突变的NSCLC标本551例，其中同时采用ddPCR和ARMS-PCR两种方法检测的样本115例(石蜡包埋组织56例，胸水脱落细胞12例，外周血47例)。所有病例均经组织病理学确诊为NSCLC，本研究经本中心医学伦理学委员会批准，所有患者及家属均已签署书面知情同意。

1.2 试剂与仪器

组织及胸水脱落细胞基因组DNA按照QIAGEN DNA FFPE Kit (QIAGEN，德国)说明书进行提取，并采用NanoDrop2000(NanoDrop Technologies,美国)紫外分光光度计对核酸进行浓度测定。外周血cfDNA按照QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN，德国)说明书提取，并使用Qubit ssDNA Assay Kit及Qubit 3.0荧光定量仪测定浓度。ARMS-PCR检测使用人EGFR基因突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法，北京鑫诺美迪医学科技有限公司，国械注准20143402145)，PCR反应使用ABI 7500荧光定量PCR仪(ThermoFisher Scientific，美国)。ddPCR按照人EGFR基因T790M检测试剂盒(上海源奇生物医药科技有限公司，沪食药监械生产许20111877号)说明书操作，使用Bio-Rad QX200 数字PCR仪(Bio-Rad，美国 )进行检测，通用试剂耗材均为伯乐公司原装进口。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 常规石蜡包埋组织切片：HE染色后观察肿瘤细胞在切片中所占比，选取肿瘤细胞大于60%区域富集至洁净的EP管中；胸水标本：低速离心收集胸水细胞沉渣。按照FFPE DNA Kit试剂盒说明书提取基因组DNA。采用NanoDrop2000测定核酸浓度。外周血采集使用cfDNA保护EDTA抗凝管，采血量8～10 mL，1 600×g离心10 min分离血浆，16 000×g离心10 min后吸取上清，置于-80 ℃保存(血浆需在采血后2 h内完成分离)。按照Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒说明书提取cfDNA。外周血cfDNA核酸浓度采用Qubit3.0荧光定量仪测定。

1.3.2 ARMS-PCR和ddPCR检测T790M突变 ARMS-PCR：按试剂盒说明书配制PCR反应体系，将DNA稀释至10 ng/μL加入PCR体系后上机检测，PCR运行程序：37 ℃ 2 min；95 ℃ 3 min；(94 ℃ 15 s，60 ℃ 35 s)×45个循环；25 ℃ 1 min。ddPCR：cfDNA样本按照试剂盒说明书取15 μL进行预扩增后取1 μL预扩增PCR产物稀释至6 μL、组织及胸水脱落细胞标本DNA测定浓度后稀释至10 ng/μL后取6 μL加入到PCR反应体系中，将含有样品的20 μL DNA反应液置于微滴发生器的样品孔中，加入70 μL微滴生成油至油孔后放置于微滴生成仪中生成纳升级的油包水液滴。微滴生成后转入96孔板中用铝箔热封膜密封，封膜后进行PCR扩增反应，扩增程序：95 ℃ 10 min;(94 ℃ 15 s, 58 ℃ 60 s)×40个循环；98 ℃ 10 min; 4 ℃ hold(注意升降温度≤2 ℃/s)。PCR反应结束后将反应板置于微滴读取仪上，打开QuantaSoft软件进行微滴荧光检测和数据分析。当样本中至少有3个微滴出现在FAM信号的阳性区域时，认为该样本T790M突变阳性。0～1个阳性微滴判为阴性，2个时需重复检测。

1.4 统计学分析

采用SPSS 23.0统计学软件进行分析。计数资料差异性分析采用χ2检验进行比较，两组间数据比较采用独立样本t检验或单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义，使用GraphPad Prism 8软件进行图表制作。

2 结 果

2.1 临床资料

本研究共纳入115例患者，其中男性53例，女性62例，年龄范围34～87岁，中位年龄61岁。病理学分型包括腺癌111例、鳞癌2例、其他类型NSCLC 2例。有明确的组织学分级的有71例，其中低分化者38例、中分化32例、高分化1例。63例可明确TNM分期，其中处于Ⅰ～Ⅱ期7例，处于Ⅲ～Ⅳ期56例。92例伴有EGFR基因敏感突变，其中19-del和L858R分别占比36.9%(34/92)和46.7%(43/92)。T790M突变状态与临床病理参数关系见表1。

表1 T790M基因突变与NSCLC患者临床病理关系

ParameterNT790M mutationT790M+T790M-χ2PPathology4.0570.132 Adenocarcinoma1117437 Squamous carcinoma211 Others202TNM stage39.265<0.001 Ⅰ+Ⅱ761 Ⅲ+Ⅳ56515 Uncertain521834EGFR mutations35.699<0.001 19del35269 L858R453510 Other mutations12111 Wild type23320

2.2 ARMS-PCR和ddPCR检测T790M突变结果比较

115例NSCLC患者标本中，ARMS-PCR检测T790M突变阳性32例，阳性率27.8%。ddPCR检测T790M突变阳性75例，平均阳性微滴数和平均突变丰度分别为250(3～2 916)和7.05%(0.039%～76.3%)。ddPCR检测T790M突变阳性率为65.2%，显著高于ARMS-PCR(P<0.05)。两种方法检测均为阳性者(ddPCR+ARMS+)32例，均为阴性者(ddPCR-ARMS-)40例，检测结果一致率为62.6%(表2)。

表2 ARMS-PCR和ddPCR检测115例NSCLC患者T790M突变结果

ddPCR+ARMS-标本43例，平均阳性微滴数和平均突变丰度分别为11和0.35%，均显著低于ddPCR+ARMS+样本(632.3，17.7%)(图1)。对于突变丰度<1%的样本，ARMS-PCR的敏感性仅为7.0%(3/43)，随着突变丰度的增加，ARMS-PCR敏感性也随之升高，说明ddPCR对于突变丰度低的标本具有更高的敏感性。

图1 ddPCR+ARMS-样本与ddPCR+ARMS+样本检测结果对比

2.3 样本类型与T790M突变检出率

ARMS-PCR检测基因组DNA(来源于组织及胸水脱落细胞标本)和cfDNA(来源于外周血)T790M突变的阳性率分别为27.9%(19/68)和27.7%(13/47)。ddPCR检测基因组DNA和cfDNA样本T790M突变阳性率分别为55.9%(38/68)和78.7%(37/47)(表3)。ddPCR检测为T790M突变阳性组中，基因组DNA样本的平均阳性微滴数显著高于cfDNA样本(327vs169,P=0.046)，基因组DNA样本的平均突变丰度也显著高于cfDNA样本(10.0%vs3.94%,P=0.003)(图2)。由此可见，组织样本突变丰度通常高于cfDNA样本，临床应优选组织样本送检。

图2 基因组DNA样本与cfDNA样本检测结果对比

表3 ARMS-PCR和ddPCR检测不同样本类型中T790M突变阳性率

3 讨 论

近年来，针对EGFR突变NSCLC患者的靶向治疗在临床应用越来越广泛和深入，T790M突变的临床检测需求也愈发明确。EGFR基因T790M突变导致第790位的苏氨酸被蛋氨酸所取代，从而增强了ATP与EGFR-TKI结合域的亲和力，导致EGFR-TKI不能有效阻断信号通路而产生耐药[13]。原发性T790M突变是EGFR-TKI疗效的不良预测因子。研究发现，靶向治疗前就同时检出EGFR敏感性突变(如19del、L858R等)和T790M突变的患者，其无进展生存期低于仅发生EGFR敏感性突变的患者[14]。据报道，发生EGFR-TKI耐药的晚期NSCLC患者，在明显临床证据提示疾病进展前的344天即可在外周血中检出T790M突变的存在[15]。由此可见，在EGFR-TKI治疗前、治疗过程中应尽早地采用灵敏准确的方法检测出T790M突变，可为EGFR-TKI种类的选择和用药方案的及时调整提供关键依据。

T790M突变的检测方法不断推陈出新，目前临床上应用广泛、价格低廉、方便快捷且灵敏度高的方法主要是ARMS-PCR和ddPCR两种。本研究采用这两种方法同时检测115例NSCLC患者不同类型标本，比较两种方法在T790M突变检测方面的性能。结果显示ddPCR较ARMS-PCR具有更高的敏感性，与既往文献报导一致[16-18]。对于突变丰度>1%的样本，ARMS-PCR和ddPCR表现出较高的一致性，但ddPCR在突变丰度<1%的外周血cfDNA样本检测中显示出较大的优势。而且，ddPCR能够进行绝对定量，可为动态监测提供重要信息。样本类型方面，组织或胸水脱落细胞包含的突变丰度高，但临床实际中大多耐药的患者已处于疾病晚期，二次活检难度大，这种情况下应首选ddPCR检测外周血cfDNA样本，协助治疗方案的选择及预后判断。

本研究同时使用ddPCR和ARMS-PCR对115例NSCLC患者进行检测分析，样本例数较大，纳入样本类型较全，全面对比了两种检测技术的敏感性、一致性以及在不同样本类型中的阳性率，为临床在检测技术的选择和样本类型选择方面提供了有价值的依据。但本研究为单中心回顾性研究，相匹配的患者血浆和肿瘤组织纳入例数较少，难以进一步对同一患者来源的基因组DNA和cfDNA样本结果一致性进行比较。

根据现有数据可知，ddPCR较ARMS-PCR具有更高的灵敏度，而且可提供突变丰度数据，在监测NSCLC患者EGFR-TKIs耐药后T790M基因状态变化方面具有更大的优势，可为临床靶向治疗方案的选择及调整供重要依据。

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