雪茄茄衣深度发酵过程中挥发性成分的变化

刘峰峰，方 欣，李林林，谭再钰，叶明樵，朱婷婷，黄友谊，潘 勇

（1.湖北中烟工业有限责任公司，湖北 武汉 430040；2.华中农业大学园艺林学学院，湖北 武汉 430077；3.华中农业大学生命科学技术学院，湖北 武汉 430077）

【研究意义】雪茄烟作为一种特殊烟草制品，以其品质特征烟气浓郁，香气醇厚丰满，吃味香苦透甜，同时相对危害较小［1］，被多数消费者所认可，近些年发展较快。雪茄烟质量评价指标中，香气是其中最重要指标之一，主要包括香气质、香气量和香型等，由香气成分的种类、含量、比例及其相互作用等决定香气量大、质纯、香型突出等特点是优质烟叶的一般要求。【前人研究进展】雪茄烟品质除受到烟叶原料［2］如品种、产地、栽培技术、采收方式等因素的影响外，晾晒、调制、发酵等加工工艺对雪茄烟叶质量同样有着至关重要的影响［3］。其中烟叶发酵是雪茄烟叶品质在田间成熟及晾制完成基础上的进一步提升，是改善雪茄烟叶品质的重要工序。研究表明，发酵过程中翻堆处理［4］、湿度［5］、温度［6］、堆积时间［7］等外部条件的变化，影响着烟叶香气、吃味等感官以及理化品质。也有通过外源添加非烟叶提取物以改善烟叶品质，在雪茄烟叶发酵时添加米酒、菊花浸提液，能够使发酵后雪茄烟叶中性致香物质含量更加协调，明显改善烟叶的香气和吃味［8］。【本研究切入点】烟叶的二次发酵，被称之为深度发酵，与初次发酵促进烟叶中化学成分的快速变化不同，二次发酵的主要目的是使烟叶成分更加协调，如香味醇、刺激性降低、点燃的持火能力增强等，是一个缓慢的醇化过程，以提升烟叶的工业可用性［9-10］。目前对于雪茄烟叶发酵方面的研究主要集中在初次发酵方面，而对于深度发酵方面的研究较少，深度发酵过程中烟叶的内在成分变化尚不明确。【拟解决的关键问题】本研究通过对实际深度发酵大生产中雪茄茄衣挥发性物质进行定性定量分析，研究深度发酵对雪茄烟叶挥发性成分的影响，为提高国产雪茄烟叶原料品质的工艺等提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试雪茄烟叶发酵样品为墨西哥HABABO 茄衣。主要仪器包括固相微萃取手柄（美国Supleco公司）、85 μm PA 萃取头（美国Supleco 公司）、TRACE 1300+ISQ7000 气质联用仪（赛默飞世尔科技）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 试验时间（供试茄衣样品发酵时间）为2019 年8 月23 日至2020 年1 月19 日，发酵过程中由经验丰富的加工人员根据堆垛发酵情况，进行翻堆处理，在发酵的不同翻堆阶段按五点法取样后混合均匀，采样时间依次为：原料（2019 年8 月23 日）、发酵前期（2019 年9 月30 日）、发酵中期（2019 年11 月8 日）、发酵后期（2019 年12 月3 日）、出堆（2020 年1 月19 日）。

参照烟草及烟草制品式样的制备和水分测定（YC/T 31-1996）的样品处理方法，将采集的样品先用毛刷去掉叶片上的细土和沙粒，将烟叶放入烘箱中，在40 ℃下烘3～4 h，直到用手捻碎即可；将烘干的烟草样品粉碎过孔径0.38 mm 筛，未过筛的细脉重新研磨过筛；将过筛粉末装入洁净干燥的试剂瓶内密封，充分摇匀，-20 ℃低温保存。

1.2.2 GC-MS 分析 准确称取烟叶粉碎后样品1.0 g 置于20 mL 顶空进样瓶中，添加50 µL 乙酸苯乙酯（1.011 µg/µL）内标，密封。顶空条件：平衡温度70 ℃、平衡时间20 min，吸附温度70 ℃、吸附时间30 min；从顶空瓶中拔出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口，在 250 ℃下解吸5 min，进行GC/MS 检测。GC/MS 条件：色谱柱，TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载 气，He；不分流进样，流速，0.8 mL/min；进样口温度250 ℃，传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，升温程序：初温60 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速度升至180 ℃，保持2 min，以6 ℃/min的速度升至260 ℃，保持2 min；电离能70 eV；质量数范围35～450 amu。

1.3 数据分析

由正构烷烃标样和发酵样品中各香气成分色谱峰的保留时间计算目标香气物质的保留指数（RIx）：

式中，RTx为目标香气物质的保留时间，n 和n+1分别为目标化合物流出前后的正构烷烃所含碳原子的数目，RTn+1和RTn分别表示他们的保留时间。经计算机通过NIST 谱库进行检索匹配，结合数据库中的匹配度和保留指数（RI）进行定性。假定校正因子为1，采用内标法进行半定量分析。

试验数据使用软件EXCEL2006、SPSS23.0 和Origin 2019 整理及绘制基本图表，火山图使用联川生物平台(www.omicstudio.cn)中云工具进行绘制与分析。

2 结果与分析

2.1 深度发酵过程中雪茄茄衣挥发性成分的组成

为了更好地了解深度发酵对雪茄茄衣香气品质的影响，采用HS-SPME/GC-MS 方法检测不同堆垛发酵时间采集的茄衣样品中的挥发性成分。从各阶段样品中共检测出37 种挥发性成分，挥发性成分具体种类及相对含量见表1。根据物质结构将它们分为6 类，包括含氮化合物11 种（29.37%）、醇类9种（24.32%）、酯类5种（13.51%）、酮类6 种（16.22%）、烃类4 种（10.81%）、醛类2 种（5.41%），可见茄衣的挥发性成分在深度发酵过程中均以含氮化合物、醇类、酮类、酯类为主。挥发物种类随深度发酵的进行有少量的增加，但无明显变化，其中有28 种挥发物存在于深度发酵的所有阶段（图1），将构成雪茄茄衣特征性的香气类型。

图1 雪茄茄衣深度发酵过程中挥发物种类韦恩图Fig.1 Wayne diagram of volatile compounds during deep fermentation of cigar wrappers

表1 SPME/GC-MS 测定雪茄茄衣各阶段样品的挥发性成分Table 1 Volatile components of cigar wrappers at different stages determined by SPME/GC-MS

2.2 雪茄茄衣深度发酵过程中挥发性成分的变化

由图2、图3 可知，在茄衣挥发物中，以挥发性烟碱相对含量最高，占挥发物总量的76.28%～83.32%，其在发酵过程中相对含量先增后减，整体呈增加趋势，与挥发物总量变化趋势相同；其次为新植二烯，占挥发物总量的11.60%～15.88%，其在发酵过程中相对含量先减后增，整体呈上升趋势。挥发性烟碱先增后减的变化趋势可能与茄衣生物碱之间的转化以及在深度发酵过程中挥发至空气中有关。新植二烯是茄衣中性挥发性成分中相对含量最高的物质，这与前人研究结果一致，其本身不带香气或香气较弱［11-13］，但对香气质、柔细度、透发性等评吸效果影响较大［14］。除烟碱及新植二烯外，茄衣挥发性成分仍以含氮化合物为主，深度发酵前后整体呈显著增加趋势，主要增加阶段在发酵前期及出堆阶段，发酵中期、后期无显著性变化；其次为酮类，变化趋势及主要增加阶段与含氮化合物一致；醇类、酯类及其他相对含量较低，其中醇类呈减少趋势，酯类呈增加趋势，但都没有显著性差异。

图2 雪茄茄衣深度发酵各阶段挥发物种类及含量Fig.2 Types and content accumulation of volatiles in various stages of deep fermentation of cigar wrappers

图3 雪茄茄衣深度发酵各阶段挥发物种类及含量变化Fig.3 Changes in types and content accumulation of volatiles in various stages of deep fermentation of cigar wrappers

2.3 雪茄茄衣深度发酵前后主要差异挥发性成分

差异挥发物的筛选能够更加明确深度发酵对雪茄茄衣挥发物的主要影响，根据雪茄茄衣深度发酵出堆样与原料中挥发性成分的含量，通过倍数变化分析（Fold change，FC）和独立样本T检验，分析了茄衣深度发酵前后具有显著变化的挥发物，以|log2FC|＞1 和P＜0.05 为标准筛选雪茄茄衣深度发酵前后主要差异挥发物，结果如图4 所示，茄衣深度发酵前后共筛选到差异性挥发成分13 种，包括酮类六氢假紫罗酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、植酮、法尼基丙酮，含氮化合物3-乙酰基吡啶、1-乙酰基吡咯烷、麦司明、二烯烟碱、2,3’-联吡啶，醇类2-甲基-十一烷醇、香紫苏醇，以及酯类（3-羟基-2,2,4-三甲基戊基）2-甲基丙酸酯。

图4 雪茄茄衣深度发酵前后的差异挥发物Fig.4 Differential volatile compounds of cigar wrappers before and after deep fermentation

3 讨论

雪茄烟叶的发酵分为初次发酵和二次发酵，初次发酵是促进烟叶成分的快速变化，主要使烟叶经历快速生化反应过程，没有经过发酵的烟叶不仅含有青杂气、土杂气、木质气，而且烟气粗糙，刺激性大；二次发酵又称为深度发酵，与初次发酵不同，主要目的是使烟叶成分更加协调，深度发酵过程中，雪茄茄衣挥发物种类变化较小，挥发性成分的变化主要在于各挥发性成分的含量方面的变化。本研究结果表明，在发酵前中期挥发性成分含量增加，但随着发酵的进行，发酵程度的增加，整体香气含量开始呈现下降趋势，说明一定程度的发酵整体上能够提高烟叶香气成分的含量，但发酵时间过长并不利于香气成分的积累，与时向东等［13］研究结果相符。本研究从雪茄烟叶整个的深度发酵过程中检测到的37 种挥发性成分中，共筛选到13 种发酵前后具有显著变化的关键挥发物，且均呈现显著上调趋势，这是本研究主要的创新之处。这13 种差异挥发物可能是深度发酵过程种烟叶成分协调的关键挥发性成分。从雪茄烟叶二次发酵过程中筛选出的13种主要的关键挥发性成分，包括六氢假紫罗酮、

香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、植酮、法尼基丙酮、3-乙酰基吡啶、1-乙酰基吡咯烷、麦司明、二烯烟碱、2,3’-联吡啶、2-甲基-十一烷醇、香紫苏醇和（3-羟基-2,2,4-三甲基戊基）2-甲基丙酸酯。雪茄烟叶关键挥发物中植酮、香叶基丙酮、法尼基丙酮、六氢假紫罗酮、β-紫罗兰酮属于质体色素降解产物，包括叶绿素及类胡萝卜素的降解产物，与烟草香气及感官质量关系密切［15］，如香叶基丙酮具有穿透性的青甜香、微玫瑰香，β-紫罗兰酮有紫罗兰香味，与香气质、香气量、杂气、刺激性、浓度和余味呈显著正相关，可增加烟草清甜香增加烟香、改善吃味和掩盖杂气的作用［16-17］，这表明叶绿素及类胡萝卜素这些质体色素的降解可能是雪茄烟叶深度发酵过程中，挥发性成分增加的主要原因，与深度发酵对烟叶品质的改善密切相关。此外，3-乙酰基吡啶、1-乙酰基吡咯烷和2,3’-联吡啶等氮杂环化合物属于非酶棕色化反应产物，具有烤香、烘焙香和坚果香等香味特征［18］。雪茄烟叶深度发酵后品质的协调，可能与这些香气物质含量的增加有关。而麦司明和二烯烟碱等烟碱类的挥发物的增加可能来自于烟碱的转化，与后期挥发性烟碱的降低有关［19］。但对于这些挥发物在雪茄烟支燃烧过程中的变化以及对烟支评吸结果的具体影响等还有待进一步的研究。

4 结论

本研究从雪茄茄衣深度发酵样品中鉴定出挥发性成分37 种，挥发物种类以含氮化合物和醇类为主，其次为酯类、酮类，烃类及醇类种类较少；相对含量以烟碱最高，其次为新植二烯，除烟碱和新植二烯外，茄衣挥发物仍以含氮化合物相对含量最高，其次为酮类物质。深度发酵处理对雪茄茄衣挥发物种类影响较小，但挥发物含量明显增加，从深度发酵前后共筛选出13 种差异性挥发物，均显著上调（log2FC ＞1、P＜0.05）。显著增加的挥发物主要包括质体色素的降解产物植酮、香叶基丙酮、法尼基丙酮等；棕色化反应的产物3-乙酰基吡啶、1-乙酰基吡咯烷；烟碱的转化产物麦司明和二烯烟碱。