环状RNA hsa_circ_004389 对甲型流感病毒复制的影响

张 舒，于小航，张 乐，苏 宁，赵丽丽，段 铭

（吉林大学动物医学学院人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 130062）

【研究意义】1976 年Kolakofasky［1］在 植物病毒中首次发现环状RNA（circular RNA，circRNA）。circRNA 是一类内源性非编码RNA［2］，由前体 mRNA 反向剪接产生，具有不同于传统线性RNA的共价闭合环状结构，无5′帽子结构和3′poly（A）尾，是一类功能强大的调控型非编码RNA［3］。circRNA 在真核生物中广泛存在，并且大部分进化保守，结构稳定，能够避免因核酸扩增或外切酶导致的降解，因此在细胞质中存在时间比线性RNA 更持久［4］。甲型流感病毒（Influenza A Virus，IAV）是单股负链RNA包膜病毒，属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），由于其传播和变异速度极快，且致病率和致死率高，严重威胁人类和动物的健康及生命安全［5-6］。然而，宿主编码的circRNA 在IAV 感染过程中的作用及其机制相关研究尚处于起步阶段。本研究探讨IAV 感染过程中宿主hsa_circ_004389的表达及其表达对IAV 复制的影响，研究结果丰富了我们对circRNA 在IAV 和宿主中互作、功能的认识。

【前人研究进展】近年来在哺乳动物中已发现数千种circRNA。circRNA 在不同种类的细胞中数量不同，尤其在脑细胞中极其丰富［7-11］。circRNA 是由mRNA 外显子或内含子反向剪接构成的共价闭合环状RNA［12］，具有复杂的生物学作用机制。作为一种新型的非编码RNA，circRNA 在许多致病过程中都发挥重要功能［13］，参与宿主的免疫应答［14-17］。例如，在汉坦病毒（Hantaan Virus，HTNV）的复制中，宿 主circ_0000479 通过间接调节RIG-I的表达阻碍病毒复制［18］。病毒编码的circRNA 在疾病发展中同样也产生非常重要的影响［19］；疱疹病毒（Epstein Barr Virus，EBV）编码的circLMP2A 在SNU-4th 细胞系中表达增加，并通过靶向miR-3908/TRIM59/p53 轴在诱导和维持干细胞表型中发挥关键作用。此外，在卡西波肉瘤相关疱疹病毒、乳头瘤病毒、脑心肌炎病毒、人巨细胞病毒等的感染中发现，circRNA 对病毒的复制也起着一定作用［20］。IAV 传染是一种相当复杂的过程，现有的研究成果指出IAV 在传播至肺部后，会促进肺部释放大量的促炎细胞激素和趋化因子，从而导致机体的免疫反应［21］。

【本研究切入点】宿主编码的circRNA 在IAV 感染复制过程中功能及机理目前尚不明确。本实验室前期基于基因芯片技术检测了IAV 感染的A549 细胞中差异表达的circRNA，其中hsa_circ_004389的表达显著上调。【拟解决的问题】为进一步探究circ_004389 在流感病毒复制中的功能，本研究在IAV 病毒感染后不同时间点和不同感染复数条件下，采用荧光定量PCR 等方法对hsa circ 004389的表达水平进行检测，探索circ_004389 和IAV 感染之间的关系。经 Poly I∶C和 LPS 处理A549 细胞后，采用荧光定量PCR 等方法检测circ_004389的表达情况，探索在IAV感染中诱导circ_004389 表达变化的诱因。然后用IFNβ 和JAK的抑制剂处理细胞后用qPCR 检测circ_004389的表达情况，探索circ_004389的表达变化和JAK-STAT 信号通路之间的关联。circ_004389 过表达和敲低后，用qPCR 和Western blot 在mRNA 和蛋白水平上检测该环状RNA 对IAV 复制的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试IAV毒株、11日龄无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）鸡胚由吉林大学动物医学学院动物传染病实验室提供，A549、THP-1、A172、Caco-2 和SY5Y 细胞由人兽共患病研究教育部重点实验室冻存。

pHB-circBasic 载体购自汉恒生物科技有限公司Trizol（TaKaRa）和反转录试剂（MonScriptTMRTlll All-in-one Mix with dsDNase）购自武汉Monad 生物科技有限公司；qPCR 反应试剂（PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix）购自美国Thermo 公司；聚肌苷酸胞苷酸（Polyinosinic:polycytidylic acid，poly I∶C）、脂多糖（大肠杆菌O55∶B5来源）和TPCK 胰蛋白酶购自美国Sigma-Aldrich公 司；Lipofectamine LTX ＆ PLUSTMReagent、Lipofectamine RNAiMAX 试剂、超纯琼脂糖凝胶购自美国Invitrogen 公司；抗IAV-M1 抗体购自美国Abcam 有限公司；抗β-actin 抗体购自美国Cell Signaling 有限公司；辣根酶标志山羊抗小鼠IgG（H+L）购自美国Santa 有限公司。

1.2 细胞培养

用含100 mg/L 青霉素、100 U/mL 链霉素和10%（V/V）胎牛血清（Hyclone）的RPMI-1640培养基（Corning）培育A549 细胞和THP-1 细胞；用含10% 胎牛血清的DMEM 培养基（Corning）培育A172、Caco-2 和SY5Y 细胞，并且将细胞置于4% CO2、37 ℃的细胞培养箱中。

1.3 病毒感染

将IAV 毒株于11 日龄SPF 鸡胚中培育，在生长48、72 h 后，将鸡胚置于4 ℃过夜并采集尿囊液。细胞密度达到60%～80%后，用PBS 溶液洗涤细胞，用含有1 mg/L TPCK 胰蛋白酶的培养基和感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）=2的病毒混匀后感作，吸附1 h 后换成正常细胞培养液继续培养。

1.4 细胞处理

用Poly I∶C 和LPS 分别处理A549 细胞：以24 孔板为例，将A549 细胞铺板，次日细胞密度达到60%～80%时，分别加入poly I∶C 和LPS。设置poly I∶C 终浓度分别为0.1、1、10 μg/mL，LPS 终浓度为1μg/mL，24 h 后提取总RNA。

IFNβ和信号通路抑制剂Ruxolitinib处理细胞：以24 孔板为例，将A549 细胞铺板，次日细胞密度达到60%～80%。分别加入FNβ 和Ruxolitinib。设 置IFNβ 终浓度分别为1、1、100 ng/mL，Ruxolitinib 终浓度分别为5、10 μmol/L。分别处理2 h 后感染IAV，方法同1.3。病毒感染24 h 后提取总RNA。

1.5 质粒、siRNA 和poly I∶C 转染

利用pHB-circBasic 载体构建hsa_circ_004389的真核表达质粒。抑制hsa_circ_004389 表达的siRNA 序列为5＇-CAGGAUUCGAUGAGAUUGA-3＇，由上海吉玛公司制备合成。按照Lipofectamine LTX＆ PLUSTMReagent 和Lipofectamine RNAiMAX试剂说明书分别进行质粒、siRNA 和poly I∶C 转染。

1.6 RNA 提取、实时定量聚合酶链反应（qPCR）和半定量PCR 检测

将经poly I∶C、LPS、IFNβ 和Ruxolitinib 不同处理后的A549 细胞使用Trizol 试剂按照说明书提取细胞总RNA。提取的RNA 按照反转录试剂盒说明书进行反转录，反转录前在PCR 仪中于37 ℃下反应 2 min，去除基因组DNA。RNA 反转录的反应条件如下：85 ℃ 15 min，42 ℃ 5 min。取5 μL 反转录产物使用 StepOne PlusTM进行实时荧光定量PCR。对于半定量PCR，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35 个循环。qPCR 和半定量PCR 检测均利用管家基因GAPDH为内参基因。引物序列如表1 所示。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，电压 120 V，电泳15 min，在凝胶成像仪（UVP EC3 Imaging System）上观察结果。

表1 PCR 引物序列及扩增片段长度Table 1 Primer sequences and length of PCR products

1.7 蛋白免疫印迹（Western blot）

A549 细胞感染IAV36 h 后，裂解细胞并获得总蛋白质，采用10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行电泳，每孔加入等量的蛋白质样品，PVDF 膜转膜，用5%脱脂牛奶溶液室温下封闭2 h。加入一抗β-actin（1︰4 000倍稀释）和IAV-M1（1︰1 000 倍稀释），4 ℃孵育过夜。辣根酶标志山羊抗小鼠IgG（H+L）和辣根酶标志山羊抗兔IgG 1︰2 000 稀释后，在室温下孵育2 h后，用ECL显影液在凝胶成像系统显影，并利用ImageJ 软件对电泳图进行灰度值解析。

试验数据应用GraphPad 软件进行分析，通过t检验进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 IAV 感染后宿主的hsa_circ_004389 表达显著上调

前期circRNA 组学数据提示宿主hsa_circ_004389的表达与IAV 感染相关。采用qPCR方法检测IAV 感染A549 细胞不同时间点后hsa_circ_004389的表达，结果（图1A）显示，hsa_circ_004389的表达随感染进程逐渐增加，并且在感染后24 h 表达量最高。同时，Ifnb1与IAVM基因的表达变化趋势和hsa_circ_004389 基本一致，不仅说明IAV 感染细胞模型的成功，而且提示hsa_circ_004389的表达上调可能与病毒复制及宿主抗病毒天然免疫应答存在潜在联系。不同MOI的IAV 感染试验表明，hsa_circ_004389的表达与病毒感染剂量呈显著正相关（图1B）。IAV感染来源于不同器官（肺、肠、脑和血液）或组织的人源细胞系，应用半定量RT-PCR 检测hsa_circ_004389的表达水平，结果（图1C）显示，hsa_circ_004389 在5 种人源细胞系中均有表达，但是只在病毒适应并易感的A549 细胞中，其表达量高低与IAV 感染呈正相关。以上结果表明，hsa_circ_004389的表达呈现出细胞类型的广泛性，也兼具特异性，且其表达与IAV的感染复制密切相关。

图1 IAV 感染诱导 hsa_circ_004389的表达情况Fig.1 Expression of hsa_circ_004389 induced by IAV infection

2.2 poly I∶C 有效诱导hsa_circ_004389 表达

为了研究hsa_circ_004389 表达的诱因，分别使用poly I∶C 和LPS 处理A549 细胞。qPCR 检测结果显示，poly I∶C 处理A549 细胞后，hsa_circ_004389 和Ifnb1的表达均与poly I∶C剂量成正相关（图2A）。与对照相比，处理后6 h时hsa_circ_004389 和Ifnb1的表达已被显著诱导（图2B），说明poly I∶C 有效激活下游的信号通路且能够诱导hsa_circ_004389 表达。LPS 处理细胞后，hsa_circ_0043891 表达未见显著改变（图2C），说明hsa_circ_004389的表达上调与Toll 样受体4（Toll Like Receptor 4，TLR4）或细菌感染无关。研究结果提示，hsa_circ_004389的表达是细胞特异性应答RNA 病毒感染的结果，并且在IAV 复制过程中产生的大量病毒RNA 可能是hsa_circ_004389 表达的主要诱因之一。

图2 poly I∶C 诱导hsa_circ_004389 表达情况Fig.2 Expression of hsa_circ_004389 induced by poly I∶C

2.3 JAK-STAT信号通路参与调控hsa_circ_004389的表达

病毒感染宿主后，宿主细胞通过体内广泛表达的模式识别受体监测病原相关分子模式的存在，模式识别受体被激活后触发一系列磷酸化或泛素化介导的信号级联反应。为了确定JAKSTAT 信号通路是否参与hsa_circ_004389的表达调控，采用干扰素β（Interferon β，IIFNβ）处 理A549细胞，qPCR 检测结果显示，hsa_circ_004389的表达和IFNβ的剂量呈现正相关（图3A），说明hsa_circ_004389 可能是I 型IFN 相关JAK-STAT 信号通路调控表达的产物。进一步应用JAK 抑制剂（Ruxolitinib）有效抑制JAK-STAT信号通路后，IAV 诱导的hsa_circ_004389的表达也显著受到抑制（图3B）。上述结果表明JAKSTAT 信号通路参与调控hsa_circ_004389的转录表达。

图3 JAK-STAT 信号通路参与hsa_circ_004389 表达的转录调控Fig.3 JAK-STAT signaling pathway participating in hsa_circ_004389 expression regulation

2.4 hsa_circ_004389 抑制IAV 复制

为了探究hsa_circ_004389 对IAV 复制的影响，应用hsa_circ_004389的真核表达质粒和siRNA 分别进行过表达和敲低实验，用qPCR 和Western blot 在病毒mRNA 和蛋白水平上检测hsa_circ_004389 对IAV 复制的影响。结果（图4）显示，hsa_circ_004389的过表达明显抑制IAV M 基因和M1 蛋白的表达；反之，应用siRNA 抑制内源性hsa_circ_004389的表达则有利于病毒复制 。研究结果表明，hsa_circ_004389 具有抑制IAV 复制的功能。

图4 hsa_circ_004389 抑制IAV 复制Fig.4 IAV replication inhibited by hsa_circ_004389

3 讨论

circRNA 开始被认为是错误剪接或剪接过程中形成的副产物［22］，随着先进生物技术的应用，我们对circRNA 也有了比较全面系统的研究。近年来，circRNA 复杂的生物结构及其生物学功能被人们熟知［23］。circRNA可以吸附微小RNA，例如，在新生小鼠中circ_000203 表达上调，可以在NMVCs 中特异性吸附miR-26b-5p 和miR-140-3p［24］。circRNA 能够竞争性影响RNA 线性剪接。例如，circMBNL1 可降低MBNL1 pre-mRNA的剪接［25］。circRNA 还可以作为蛋白质翻译的模板，也可以通过结合蛋白质发挥功能。

近几年，研究人员对宿主编码circRNA 在病毒感染宿主细胞过程中的作用也展开了相关研究，如恒河猴淋巴滤泡病毒、艾滋病毒、马立克病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒等［26-28］。转移性鼻咽癌组织中的疱疹病毒（Epstein-Barr virus，EBV）编码的环状RNA circRPMS1的表达显著增加。敲低circRPMS1的表达可以诱导EBV 阳性鼻咽癌的细胞凋亡，对抗细胞侵袭和抑制细胞增殖。circRPMS1 功能的发挥可能是通过吸附miR-203、miR-31 和miR-451 来实现［29］。卡锡波肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma herpesvirus，KSHV）和EBV 编码的circRNA，在这两种病毒相关的肿瘤中均有高表达，说明这些circRNA 促进这两种肿瘤病毒的致病作用，但其功能及作用机制仍有待进一步研究［30］。已有的研究表明，circRNA 既可以参与宿主抗病毒天然免疫反应，也可以参与病毒复制［31-32］。hsa_circ _ 004389是一个新发现的circRNA，在甲型流感病毒中的表达和作用机制尚不明确。上述差异表达circRNA 在病毒感染致病或宿主抗病毒应答中的功能及其分子机制的研究尚未广泛展，亟待探究。

这些组学数据不仅证实病毒感染能改变宿主circRNA的表达模式，而且说明circRNA 在病毒与宿主的相互作用中扮演重要角色，既有可能是宿主抗病毒染的工具，也有可能成为病毒重塑有利于自身复制的细胞内微环境的利器。实验室基于IAV 感染A549 细胞的芯片分析筛选到众多差异表达的circRNA,hsa_circ_004389 是明显差异表达的circRNAs 之一。在本部分研究中，我们拟充分验证表达hsa_circ_004389 与IAV 感染之间的关联，研究其表达的诱因，探究其表达与转录因子信号通路之间的关系。hsa_circ_004389与IAV 感染剂量和感染时间呈正相关，在5 种细胞系中检测了hsa_circ_004389的表达，发现hsa_circ_004389 表达量增加具有细胞特异性。用poly I∶C 和LPS 处理A549 细胞，验证了hsa_circ_004389 表达量的改变是机体特异性应答IAV感染的反应。用JAK 抑制剂Ruxolitinib 和IFNβ处理细胞，hsa_circ_004389 被进一步鉴定为宿主抗IAV 因子，其表达受JAK/STAT 信号调节。功能学试验显示hsa_circ_004389 能够抑制IAV 复制和增殖，更好地佐证了其参与宿主天然抗病毒免疫应答，但其抗病毒的作用机制还需进一步研究。

4 结论

在IAV 感染A549 细胞中circ_004389的表达显著上调。RT-qPCR 检测在IAV 诱导的A549细胞中circ_004389的表达显著增加并且其表达水平和poly I∶C 呈现显著剂量依赖性；LPS 处理细胞后circ_004389的表达没有明显变化，证明circ_004389 水平的增加与复制过程中病毒RNA的积累有关，是细胞特异性应答IAV 感染的产物。IFNβ 和Ruxolitinib 处理的A549细胞中，circ_0050463的表达降低，证明JAK-STAT信号通路参与其表达。应用siRNA 抑制内源性circ_004389的表达能促进IAV的感染；反之，circ_004389的过表达明显抑制IAV M 基因和M1蛋白的表达。研究结果表明，circ_004389 具有抑制IAV 复制的功能。本研究结果表明，hsa_circ_004389 是宿主应答IAV 感染的产物，为潜在的细胞Ⅰ型IFN 应答IAV的拮抗因子，研究结果丰富了对circRNA 功能的理解，为探究IAV 与宿主相互作用提供了新视角。