剑麻可可毛色二孢叶斑病菌的鉴定及其室内药剂筛选试验

关天博，崔晓东，陈恺宏，刘琼光

（华南农业大学植物保护学院，广东 广州 510642)

【研究意义】剑麻（Agave sisalanaPerr.ex Engelm.）也称为菠萝麻、龙舌兰麻，属于龙舌兰科龙舌兰属的多年生硬质纤维作物，主要分布在热带地区［1］，我国主要在广东、广西和海南等地种植［2］。剑麻纤维及其剑麻汁液提取物被广泛应用于国防、石油、交通运输、冶金、工矿、捕捞和农林牧业、食品、制药等领域，具有较大的综合利用价值和较广阔的开发应用前景［3-7］。在我国广东、广西两大优势剑麻种植区，其产量和种植面积均占全国95%以上。近年来，在广东湛江地区剑麻上严重发生一种叶斑病，其症状为：在剑麻叶片产生近圆形、椭圆形黑色病斑，病部凹陷，病健交界明显，后期病斑可变为灰白色，导致剑麻叶片大面积坏死，严重影响产量。明确该叶斑病的病原菌种类以及测定该病原菌对化学药剂的敏感性，对该剑麻叶斑病的有效防治具有实际意义。【前人研究进展】目前，我国剑麻主栽品种为H.11648，该品种特点是产量较高，但易感病［2］。由于剑麻生产种植规模较为集中，长期栽种品种较为单一，导致病虫害问题比较突出。剑麻主要病害有斑马纹病（Phytophthora nicotianae）、茎腐病（Aspergillus niger）、紫色尖端卷叶病、叶斑病（Dothiorella sisalanae.）、褐斑病（Diplodia natalensis）、炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）和溃疡病（Neoscytalidium dimidiatum）等［2,8-11］。其中，剑麻斑马纹病在剑麻生产中是为害最为严重、发生规模最大的病害，其病原菌可侵害剑麻各个部位，严重者可导致剑麻植株死亡［8］。茎腐病是剑麻另一种常发病害，病原菌主要通过伤口侵入，使侵染部位腐烂发臭［9］。剑麻紫色尖端卷叶病最初于2001 年在海南省发现，近年来在各剑麻产区都有发生。该病的发生可能与一种蜡蚧有关，导致剑麻植株顶部尖端叶片边缘变紫，并向内卷曲，同时产生大量褪绿黄斑，严重时可导致植株根部枯死甚至植株死亡。除上述3 种病害外，近年来剑麻叶斑病、炭疽病也逐渐上升为主要发生病害，它们严重为害植株叶片，导致剑麻叶片失去利用价值［2,9］。【本研究切入点】2019 年，在广东省湛江市的剑麻种植基地中，发生一种剑麻叶斑病，该病害在剑麻种植区时有发生，对当地剑麻产业构成威胁，然而，迄今引起该剑麻叶斑病的病原尚不清楚。【拟解决的关键问题】本研究对剑麻叶斑病病原进行分离鉴定及其室内药剂筛选，以期为该病的防治提供指导。

1 材料与方法

1.1 病害标本采集

2019 年6－12 月，在湛江地区剑麻种植产区采集叶片近圆形、椭圆形或不规则形黑色斑点、病部内陷、边缘无晕圈等明显症状的剑麻病叶，装入密封袋，对样品进行拍照记录，带回华南农业大学植物病理实验室，进行病原菌的分离和纯化。

1.2 病原菌的分离培养及纯化

采用组织分离培养法，所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA（Potato Dextrose Agar）对剑麻叶斑病菌进行分离，步骤为：选取带有明显症状的剑麻叶片组织，用灭菌水冲洗，在病健交界处用无菌小刀切取大小4～5 mm的组织块，用75%酒精表面消毒1 min，转置于0.1%次氯酸钠溶液中消毒3 min，无菌水清洗3～4 次，转移到灭菌滤纸上。将消毒后的病组织均匀摆放到PDA平板上，每皿4～5 块，放好后轻微按压，防止病组织掉落，于30 ℃恒温培养箱中培养3～5 d。待病组织边缘长出菌丝后，用灭菌牙签在菌落边缘挑取一小块培养基，转移到新的PDA 培养基上，多次重复纯化，最终获得纯培养菌。

1.3 病原菌的致病性测定

将分离、纯化得到的分离物在PDA 平板上30 ℃培养2～3 d，接种针划取大小一致的小菌块，备用。将种植于温室盆栽中的健康剑麻叶片用70%酒精表面消毒，灭菌水冲洗1～2 次，用消毒针在叶片上轻微刺伤，用打孔器取培养2～3 d的分离物菌丝块（带有PDA 培养基）贴于叶片伤口处，每片叶接种2 处，以无菌PDA 培养基作为对照。所有接种处均用双层纸巾轻微包裹，防止菌饼滑落，对接种好的剑麻叶片表面喷灭菌水保湿24 h，每个分离物接种3 片叶，将所有剑麻植株置于温室中培养。约1 周后待剑麻叶片表面出现发病症状，观察并记录发病情况，并与所采集到的田间病害症状比较。若有发病，则从发病处取病健交界组织，对病原菌再次进行分离纯化，观察是否获得与分离相同的致病菌。

1.4 科赫氏法则验证

从接种剑麻发病症状与田间症状相似的部位，重新分离病原菌，参照1.2 方法，通过菌落形态、菌丝和分生孢子等形态特征进行显微观察，确定是否与接种的病原菌一致。

1.5 病原菌的分子生物学鉴定

选取科赫氏法则验证后确定为致病菌的菌株，进行ITS 序列分析。采用DNA 提取试剂盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕，按说明书提取病原菌DNA，进行PCR 扩增。采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物，ITS1（5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG -3’）和ITS4（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’）［12］。引物合成及PCR 产物序列测定由英骏生物技术有限公司完成。

PCR扩增体系：10×PCR缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，20 μmol/L 引物各0.5 μL，5 U/μL Taq 酶0.5 μL，模板DNA 1 μL，加灭菌双蒸水至25 μL。PCR 反应条件：94℃预热3 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，共35 个循环；72℃延伸5 min。

将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取扩增条带清晰且长度约为540 bp的目标条带，切胶回收，送英骏生物技术有限公司测序，将测序结果，在GenBank 数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行BLAST 比对分析。

1.6 病原菌药剂毒力测定

采用菌丝生长速率法进行杀菌剂室内毒力测定。供试杀菌剂为98.5%百菌清原粉、97%甲基硫菌灵原粉、97% 咪鲜胺原粉、95% 己唑醇原粉、97%戊唑醇原粉、96.5%苯醚甲环唑原粉、90.65% 氟吡菌酰胺原粉、93% 醚菌酯原粉，以上药剂由华南农业大学植物细菌和杀菌剂研究室提供。称取原药各0.1 g，用10 mL 无水乙醇溶解，配置成母液。在预实验及查阅相关资料［13-16］的基础上，将8 种药剂原药各设置成5 个对应浓度梯度，每个浓度梯度3 个重复。按照各待测药剂的不同浓度，分别加入PDA 培养基中，配置好不同药剂的含毒介质PDA平板。各浓度药剂取1 mL 分别加入49 mL 融化并稍冷却的PDA 培养基中，充分混匀，以等量无水乙醇的PDA 为对照。待培养基冷却晾干后，用直径5 mm的打孔器在培养3 d的待测菌PDA 平板上，获得均匀一致的菌饼，将菌饼转接到含有不同药剂的PDA 培养基中央，以接种无水乙醇的PDA 平板为对照。30℃恒温培养箱3～5 d，待对照平板菌落直径约85 mm 时，用十字交叉法测量各菌落直径，计算该浓度药剂对病菌的抑制率：

抑制率（%）=〔1-（处理菌落直径-菌饼直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）〕×100

依次求得毒力回归方程、相关系数和EC50值［17］。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离鉴定

2.1.1 症状观察 观察田间发病剑麻植株，发现病斑主要集中在剑麻叶片前半段，且发病处病斑较为密集（图1A）。叶片上病斑近圆形、椭圆形或者不规则，黑色凹陷，病健交界明显，外围无黄晕，后期叶肉组织发白坏死，部分病斑联结成较大的条状病斑，叶片边缘发病，呈不规则形大斑，向叶片中部内陷，后期变为灰白色（图1B、C），初步判断该病害为真菌性病害。

图1 剑麻叶斑病的发病症状Fig.1 Symptoms of sisal leaf spot disease

2.1.2 病原菌的分离及纯化 选取典型症状剑麻病组织，用PDA 培养基分离，经多次纯化共获得11 个真菌分离物，进一步用科赫氏法则对这11个疑似病原真菌进行验证。

2.1.3 病原菌的致病性测定 将分离获得的11 个真菌分离物在室内进行致病性测定，结果发现有2 种真菌出现与田间症状相似的症状（图2），其余9 个分离物接种均不发病。接种编号为JMLT06的真菌，其剑麻叶片出现明显的真菌性叶斑病症状，病斑黑色，病部内陷，病健交界明显，组织坏死（图2A）。接种JMLT08的剑麻叶片出现与JMLT06相同的症状，但病部中央颜色变为灰白色，叶片组织坏死更为严重（图2B）。接种对照剑麻叶片，未见任何发病症状，只有戳刺后留下的针孔（图2C）。接种JMLT06 和JMLT08 两个菌株后剑麻的发病症状与田间症状（图2D）相似，表明JMLT06 和JMLT08 两个真菌为致病菌。

图2 分离的剑麻叶斑病菌接种剑麻叶片症状Fig.2 Symptoms of sisal leaves inoculated with isolates of sisal leaf spot disease

2.1.4 科赫氏法则验证和病原菌的形态观察 从接种后发病的剑麻叶片组织中再次进行分离培养，获得的纯培养菌其菌落形态特征非常相似，生长迅速，2～3 d 即可铺满整个培养皿（D=85 mm）。在PDA培养基上菌落圆形，放射状，边缘不整齐；菌丝生长初期为白色，产生丰富的气生菌丝，似绒毛状，随着生长时间延长，菌丝转变为灰黑色，在显微镜下观察出现分隔、分支的情况，菌落背面为蓝灰色或近黑色（图3）。

图3 剑麻叶斑病菌在PDA 平板上的菌落形态Fig.3 Colony morphology on PDA plate of pathogen causing sisal leaf spot disease

显微镜观察发现其分生孢子椭圆形，单孢，深褐色，中间有一条中横隔隔开，形似双胞结合在一起（图4）。根据分生孢子的形态特征，初步鉴定为毛色二孢属（Lasiodiplodia）。

图4 叶斑病菌JMLT08的分生孢子形态Fig.4 Conidial morphology of JMLT08 leaf spot disease

2.1.5 病原菌的分子生物学鉴定 利用ITS 通用引 物ITS1（5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG -3’）和ITS4（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’）分别对JMLT06 和JMLT08 菌株进行PCR 扩增，分别得到547 bp 和544 bp 目的片段，纯化目的片段后进行测序，将测序结果进行同源性对比，发现致病菌的序列在GenBank 中与可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）（GenBank:MN831966.1）的同源性达到99%以上，构建系统发育树，结果发现JMLT06 和JMLT08 均与Lasiodiplodia theobromae聚为一类（图5）。结合其形态特征，可将JMLT06 和JMLT08 初步鉴定为可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。

图5 JMLT06 和JMLT08 菌株ITS 序列的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of ITS sequences of JMLT06 and JMLT08 strains

2.2 杀菌剂对病原菌的毒力测定

选择JMLT08 菌株，对其进行室内平板药剂筛选试验，结果发现在供试的8 种杀菌剂中，EC50值存在明显差异。EC50值反映杀菌剂对病原菌的抑制作用，EC50值越小，表明药剂对病菌毒力越强。本研究结果（表1）表明，98.5%百菌清的杀菌毒力最强，EC50值为0.000132 μg/mL。其次为95%己唑醇、97%咪鲜胺、97%戊唑醇、96.5%苯醚甲环唑等4 种药剂，均具有较好的杀菌活性，4 种药剂的EC50值均低于1 μg/mL，分别为0.0246、0.0603、0.0623、0.10 μg/mL。90.65%氟吡菌酰胺和97%甲基硫菌灵对JMLT08毒力稍低，EC50值分别为1.28、1.83 μg/mL。在这8 种药剂中，毒力最差的为93%醚菌酯，EC50值为60.00 μg/mL。

表1 8 种药剂对JMLT080 菌株的毒力测定结果Table 1 Toxicity test results of 8 fungicides to JMLT08 strain

依据EC50值小于2 μg/mL的标准，表明百菌清、己唑醇、咪鲜胺、戊唑醇、苯醚甲环唑、氟吡菌酰胺和甲基硫菌灵等7 种药剂对可可毛色二孢菌均具有较好的杀菌效果，其中效果最好的为百菌清。

3 讨论

以往研究表明，我国剑麻上共发生有炭疽病、茎腐病、紫色尖端卷叶病、条纹病、斑马纹病、黑斑病、褐斑病、叶斑病、梢腐病和根结线虫病等10 种剑麻病害［2,8-11］，其中5 种剑麻真菌病害，其病原菌分别为黑曲霉（Aspergillus niger）引起的剑麻茎腐病、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的剑麻炭疽病、蒂腐色二孢（Diplodia natalensis）引起的剑麻黑斑病、新暗色柱节孢(Neoscytalidium dimidiatum)引起的剑麻溃疡病和交链格孢(Alternaria alternata)引起的剑麻叶斑病，茎腐病、叶斑病和炭疽病对剑麻的品质和产量影响最大［2,9］。本研究鉴定了剑麻上的一种叶斑病病原菌，通过对病原菌的分离、纯化和致病性测定，以及对病原菌的形态观察和ITS序列分析，将该剑麻叶斑病病原菌初步鉴定为可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae），由可可毛色二孢菌引起的剑麻叶斑病目前在国内还未见报道。

可可毛色二孢菌是一种在热带和亚热带地区广泛分布的土传病原真菌，其寄主范围广泛，可侵染500 多种植物，引起叶斑、溃疡、梢枯、枝枯、根腐、果腐、流胶、坏死等症状［18］。本研究发现，剑麻也是可可毛色二孢菌的寄主之一。据报道，可可毛色二孢菌在海南为害菠萝［19］，在广西可为害芒果［13］，此外，茶树、桉树、橡胶树、朱槿等作物上也发现该真菌侵染［15,16,20,21］。可可毛色二孢菌侵染茶树后，可在叶片上产生褐色或黑色点状病斑，随后逐渐扩大为不规则病斑，最后导致叶片坏死［20］；侵染橡胶树可引起叶斑病，且橡胶树叶片边缘向上卷曲［16］；而侵染桉树和朱瑾则分别产生枝枯和茎腐症状，严重可致植株死亡［15,21］。据报道，可可毛色二孢菌还可引起春芋叶斑病［22］、猕猴桃叶斑病［23］和樟树溃疡病［24］等，由此可见，可可毛色二孢菌的寄主范围非常广，且症状类型不一，但本研究中侵染剑麻的可可毛色二孢菌是否侵染其他植物，有待于进一步研究。

为有效防治可可毛色二孢菌引起的剑麻叶斑病，进行了室内药剂毒力筛选试验。结果表明，百菌清、己唑醇、咪鲜胺、戊唑醇、苯醚甲环唑、氟吡菌酰胺和甲基硫菌灵等7 种药剂对可可毛色二孢菌均具有显著的抑菌效果。相关研究表明，咪鲜胺、戊唑醇、苯醚甲环唑、甲基硫菌灵等药剂对可可毛色二孢菌引起的桉树、芒果、大叶伞和橡胶树病害有较好的防治效果［13,15-16,25］，其中25%咪鲜胺对引起桉树枝枯病的可可毛色二孢菌的EC50值为0.03 mg/L［15］，戊唑醇悬浮剂对引起芒果流胶病的可可毛色二孢菌的EC50值为0.1662 μg/mL［13］，10% 苯醚甲环唑水分散性粒剂对引起大叶伞干腐病的可可毛色二孢菌的EC50值为0.10 μg/mL［25］，70% 甲基硫菌灵对引起橡树叶斑病的可可毛色二孢菌的EC50值为0.2019 μg/mL［16］。本研究结果表明，苯醚甲环唑对剑麻可可毛色二孢菌的EC50值与前人研究结果相符，戊唑醇的EC50值明显低于前人研究，而咪鲜胺和甲基硫菌灵的EC50值明显高于前人研究结果，其原因可能是：（1）侵染剑麻的可可毛色二孢菌与侵染其他植物的可可毛色二孢菌对同一药剂的敏感性不同；（2）药剂的剂型和含量不同，本研究所用的药剂均为原药粉剂，均比前人所用的药剂含量高。此外，百菌清、氟吡菌酰胺和己唑醇对可可毛色二孢菌的毒力作用以往未见报道，本研究发现百菌清对剑麻可可毛色二孢菌的毒力最强，其EC50值为0.000132 μg/mL，进一步丰富了前人研究结果，可用于指导生产上剑麻可可毛色二孢叶斑病的化学防治。

4 结论

广东湛江地区发生的一种剑麻叶斑病，初步鉴定是由可可毛色二孢真菌（Lasiodiplodia theobromae）引起，病菌侵入剑麻叶片，产生大量近圆形、椭圆形黑色病斑，病部凹陷，病健交界明显，导致剑麻叶片大面积坏死，严重影响产量，生产上需要警惕该叶斑病的防治。该病原菌对百菌清、己唑醇、咪鲜胺、戊唑醇、苯醚甲环唑、氟吡菌酰胺和甲基硫菌灵等药剂敏感，这些药剂可用于剑麻可可毛色二孢叶斑病的化学防治。